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碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究 生物技术 1101 班 其曼古丽麦麦提 201131301028 摘要摘要：经过匀浆，正丁醇处理，凝胶过滤等步骤，从猪肝中部分纯化 了碱性磷酸酶。以磷酸苯二钠为底物，测得该酶的最适 pH 为 10， 最适温度为 37， Km = 1.6565。KH2PO4 对酶的活性有不同程度的抑制作用。 关键词关键词：猪肝，碱性磷酸酶，分离纯化，性质 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,简称 AKP) 是一种底物专一性较低 的磷酸单酯酶，广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参 与了磷酸基团的转移和代谢过程【1】。它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作 用【1】。海洋中的甲壳动物锯缘青蟹体内的碱性磷酸酶是其赖以生长、生存的重 要酶类之一，它对海水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的形成与分泌都 具有重要作用【2】。提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究 【3】 。由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中 【4】 。为了满足生产实践上的需要，仅国内以猪肝为材料来分离纯化碱性磷酸酶 并对其性质进行分析的研究工作即已有若干。 1.11.1 材料与方法材料与方法 1.1.1 实验材料 新鲜的猪肝脏。 1.1.2 试验仪器 玻璃匀浆器，离心机，加样抢，恒温水浴锅。 1.1.3 试验试剂 0.5mol/L 醋酸镁溶液；2，0.1mol/L 醋酸钠；3，0.01mol 醋酸镁- 0.01mol/L 醋酸钠溶液；4，Tris-HCl PH8.8 缓冲液；5，正丁醇；6，丙醇； 7，95%乙醇；8，0.04mol/L 作用物底物；9，0.1mol/L 碳酸盐缓冲液（PH 10.0） ；10，碱性磷酸酶液；11，0.5mol/L NaOH 溶液；12，0.3%-氨基安替比 林；13，0.5mol/L 铁氰化钾；14，基质液，15，0.2m 甘氨酸；16，0.2NaOH； 1.1.4 试剂配制 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至 1000ml。0.1mol 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至 1000ml。0.01mol/L 醋酸镁-0.01mol/L 醋酸钠溶液：准确吸取 20ml0.5mol/L 醋 酸镁溶液及 100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混合后定容至 1000。Tris-HCl PH8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 12.1g 用蒸馏水溶解后定容至 1000ml， 即为 0.1mol/LTris 溶液。取 100ml0.1mol/LTris 溶液，加蒸馏水约 780ml，再 加 0.1mol/L 醋酸镁溶液，混合后用 1%冰醋酸调 PH 为 8.8，用蒸馏水定容至 1000ml。0.04mol/L 作用物液：称取 10.16 磷酸二甲苯二钠，用煮沸后冷却的 蒸馏水溶解并稀释至 1000ml，加 4ml 氯仿防腐，存于棕色瓶内，放于冰箱内保 存。0.1mol/L 碳酸盐缓冲液:取无水碳酸钠 6.36 及碳酸氢钠 3.36，溶解于蒸馏 水中，并稀释至 1000ml。碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶 5mg，用 PH 缓冲 液配制成 100ml，放置冰箱内保存。0.3%4-氨基安替比林：称取 3g4 氨基安替 比林及碳酸氢钠 42g，用蒸馏水溶解至 1000ml。0.5%铁氰化钾：称取 10g 铁氰 化钾及 30g 硼酸各溶于 800ml 蒸馏水中溶解后两液混合加水至 2000ml。基质液： 称取磷酸苯二钠.2H2O 6g，4-氨基安替比林 3g，分别溶于煮沸冷却的蒸馏水中， 两液混合并稀释至 1000ml， 加 4ml 氯仿防腐。 1.21.2 试验方法试验方法 1.2.1 碱性磷酸酶的分离纯化 取新鲜猪肝 20g 剪成组织糜，加入 0.1mol/L 醋酸镁0.1mol/L 醋酸钠 60ml，在电动匀浆器上匀浆。取 32.5ml 肝匀浆液与 10ml 的正丁醇混合，用玻 璃棒充分搅拌 35 分钟后室温放置 30 分钟，然后用四层纱布过滤。在 23.5ml 的滤液中加入等量的冷丙酮（-10保存）混匀后 3000 转冰冻离心 5 分钟，离 心后弃去上清液取沉淀，然后加入 0.5mol/L 醋酸镁 20ml 混匀，用量筒量取 29.5ml 悬液，加入 96%乙醇 12.9ml 至 30%， 3000 转离心 5 分钟。离心后弃沉 淀取上清液 33.5ml，加 96%乙醇 27.9ml 至 65%， 3000 转离心 5 分钟。将上清 液弃去，在沉淀中加入 0.1mol/L 醋酸镁0.1mol/L 醋酸钠 20ml 溶解，再加入 96%乙醇 9.75ml 至 30%， 3000 转离心 5 分钟，此次离心后弃沉淀取上清液 29.5ml，加入 96%乙醇 24.5ml 至 60%， 3000 转离心 5 分钟，离心后取沉淀， 加入 0.5mol/L 醋酸镁 15ml 溶解，使溶液总体积为 17.5ml，加入 99.5%丙酮 8.2ml 至 33%， 3000 转离心 5 分钟，取上清液加入 99.5%丙酮 7.65ml 至 50%，3000 转离心 10 分钟，得到沉淀后加入 pH8.8Tris 缓冲液 10ml 溶解，溶 液即为部分纯化的碱性磷酸酶，将其分装成 1ml/瓶，置-20冰箱保存。 1.2.2 碱性磷酸酶的动力学鉴定-Km 测定 取大试管 7 支，按下表操作： 加入酶液，混匀之后立即记时，各管在 37水浴中准确保温 15 分钟后，加入 0,5molNaoh 液 1.0ml 以终止反应。 显色：各管加入 0.3%4 氨基安替比林 1.0ml 和 0.5%铁氰化钾 2.0ml，充分 混匀，放置 10 分钟，以 0 管为对照在波长 510nm 下比色，记录各管的吸光度。 作图：所测各管的吸光度代表各管中的反应速度 v，以之为纵轴，以作物 浓度 s 为横轴，在坐标纸上链接个点作图，观察曲线的形状。 以各吸光度值得倒数为纵轴，以作物浓度的倒数为横坐标，作图求出 km 值。 1.2.3 碱性磷酸酶的最适 PH 及酸性稳定性试验 PH-活性曲线的制作 取 6 支试管，按下表操作 管号 1 2 3 4 5 0 反应 PH 8 9 10 11 12 10 相应 PH 缓冲液 各加 0.5ml 酶液 各加 0.1ml（0 号管酶液在铁氰化钾之后加） 37预热 5 分钟 预热的基质液 各加 3.0ml 37精确保温 15min 各加 1.0ml 碱性溶液终止反应 0.5%的铁氰化钾 各加 2.0ml 静置 10min A510 测试各管的 A510 值，以反应 Ph 值为横坐标，A510 为纵坐标绘制 PH 活性 曲线，求出碱性磷酸酶在本实验下的最适 PH。 酸碱稳定范围的测定 取 6 支试管，按 1 至 5 管编号，空白管为 0 号，按下表操作 管号 1 2 3 4 5 0 处理 PH 8 9 10 11 12 10 相应 PH 缓冲液 各加 0.1ml 酶液 各加 0.1ml 37处理 1 小时 0.1MPH10 的碳酸盐缓冲液 各加 0.5ml 预热的基质液 各加 3.0ml（0 号管基质液在铁氰化钾之后加） 37精确保温 15min 各加 1.0ml 碱性溶液终止反应 0.5%的铁氰化钾 各加 2.0ml 静置 10min A510 测得各管 A510 值，以 PH 为横坐标，A510 为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线， 并分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。 1.2.4 碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性试验。 温度-活性曲线的制作 取 4 支试管，按下表操作 管号 1 2 3 0 反应温度（） 25 37 80 37 稀释酶液 各加 0.1ml（0 号管酶液在铁氰化钾之后加） 预热的复合基质液 各加 3.0ml 分别在不同温度下精确反应 15min，各加 1.0ml 碱性溶液终止反 应 各加 0.5%的铁氰化钾 2.0ml 静置 10min A510 测各管的 A510,以反应温度为横坐标，A510 为纵坐标，绘制温度-活性曲线 图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。 热稳定性 取 4 支试管，按下表操作 管号 1 2 3 0 热处理温度（） 25 37 80 25 热处理时间（分） 15 15 15 15 酶液 （ml） 各加 0.1ml（0 号管酶液在铁氰化钾之后加） 在上述相应温度的恒温水浴内放置相应时间后取出，立即以流动水冷却并 置于 37恒温水浴锅中预热 2 分钟 预热的复合基质液 各加 3.0ml 37精确反应 15min，各加 1.0ml 碱性溶液终止反应 各加 0.5%的铁氰化钾 2.0ml 静置 10min A510 测出各管 A510 值，以处理温度为横坐标，A510 为纵坐标。绘制热稳定曲 线，并分析在本实验条件下的碱性磷酸酶的热稳定性值范围。 1.2.5 抑制剂类型鉴别 KH2PO4 的抑制剂作用 取 6 支试管，按下表操作 管号 1 2 3 4 5 0 40mmol/L 底物溶液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0 碳酸盐缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 蒸馏水 0.80 0.70 0.60 0.50 0.10 0.90 0.25mKH2PO4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37预热 5min 酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 最终底物浓度 2 4 6 8 16 0 37精确保温 15min4 按顺序各加 1.0ml 碱性溶液，1ml 4-氨基安替吡啉，2ml 铁氰化 钾 静置 10min A510 测出各管 A510 值，以底物浓度倒数为横坐标，作图，观察直线在纵轴和横 轴上的交点位置并计算其 Km 值，于未加抑制剂时的 Km 值比较，说明该抑制剂 属于何种类型。 2 2 结果与分析结果与分析 2.1 酶的分离纯化 将猪肝匀中加入正丁醇，经过滤后，滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离 纯化，获得较为纯净的碱性磷酸酶。分装在 1ml 的小管，一共 10 管，在-20 的冰箱中保存。 2.2 Km 的测定 在 Km 的测定时，各管的吸光度如下： 0.443、0.612、0.508、0.559、0.550、0.589、0.638 由于，第二管测得的吸光度明显不对，所以，取后五管的吸光度的倒数作 纵坐标，以后五管的作用物浓度的倒数为横坐标作图。 根据数据作图如下： 根据 y=2.4182x+1.4598 算出 Km 值，即 y=0,x=-14598/24182=-1/Km 所以， Km=1.6565。 2.3 碱性磷酸酶的最适 pH 及酸碱稳定性 pH 对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活 性。pH 对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大影响。在 37的测活 体系中，改变缓冲液的 pH 值,测各管的吸光度。 以 pH 为横坐标，A510为纵坐标绘制 pH-活性曲线，如图所示： 根据数据及图可知本实验中碱性磷酸酶的最适 PH 为 10. 酶在过酸或过碱的条件下很容易变性失活，酸碱度对酶的稳定性有很大的 影响。以 pH 为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线，如图所示： 根据实验数据和图可知 pH 为 10 的情况下该酶最稳定，pH 过高或过低会影 响酶的稳定性。 2.4 最适温度及热稳定性 对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响， 一方面与一般的化学反应一样，温度加速酶反应速度；另一方面该酶是蛋白质， 温度加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度 升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大 值时的温度称为酶反应的最适温度。在不同温度条件下测定酶的活性，以反应 温度为横坐标，A510 为纵坐标，绘制温度-活性曲线图： 根据数据和图可知 37时，酶活性最高。 将酶在 25,37,80下处理，然后再在一定温度条件下测定酶活力。 以处理温度为横座标，A510为纵坐标绘制热稳定曲线： 观察图可知 37时该酶稳定性最好。 2.5 抑制剂类型鉴别 抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。根据抑制剂与酶结合 的特点可分为不可逆抑制剂和可逆抑制剂两种类型。 在可逆抑制类型中，根据 抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反 竞争性抑制三种。在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能 形成 EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值 K，m 增加，酶的最大反应速度 Vm 不变。 在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成 EIS，但是 EIS 不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm 降低而 Km 不变。 在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成 EIS，即 Ki=，其动力学特征是；Km 和 Vm 都发生了变化。本实验中 KH2PO4作 为碱性磷酸酶的抑制物。根据实验步骤进行操作可测得吸光度，以底物浓度倒 数为横坐标，吸光度为纵坐标作图： 根据 y=4.1376x+1.1787算出 Km 值，即 y=0, x=-11787/41376=-1/Km 所以， Km=3.5103。根据 Km 值和实验指导上的三种抑制类型的图片，可以看出这个抑 制剂是反竞争性抑制。 3 3 结果与讨论结果与讨论 碱性磷