毕业设计（论文）-甘蔗ROC16的转基因研究.doc

红河学院本科毕业论文 (设计)2010年度本科生毕业论文（设计）甘蔗roc16的转基因研究院 系： 生命科学与技术学院 专 业： 生物科学 年 级： 2006 学生姓名： 学 号： 导师及职称： 2010年6月摘 要甘蔗(saccharum officenarum l.)是我国最主要的糖类经济作物，其生产率的大小将直接影响到蔗农的收入和国民经济的稳定发展。但是在实际的甘蔗生产过程中，各种病虫害的侵害将大大降低甘蔗的产量和品质。在众多的病虫害中，常见的甘蔗害虫是甘蔗螟虫（piatraea saacharalis f.）也是最主要的虫害。本研究在于将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（sck）及苏云金杆菌毒蛋白基因（bt）导入甘蔗roc16种质中。探索获得了农杆菌介导roc16转基因研究的相关科学数据：诱导甘蔗roc16愈伤组织的最佳2，4-d浓度为2.5 mg/l（诱导率为91.7%）介于roc16愈伤组织会因2，4-d浓度过高而不易诱导芽分化，在实际的愈伤诱导中，采用了1 mg/l（诱导率为72.9%）。采用2 mg/l 6-ba+1 mg/l kt+200 mg/l car进行芽的高浓度培养基中诱导刺激分化15天，再转入0.5 mg/l 6-ba+0.25 mg/l kt+200 mg/l car的低浓度培养基中15天，最后转入1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car培养基中持续分化，可解决roc16在常规浓度下（1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car）难以诱导芽分化问题。关键词：甘蔗；roc16；农杆菌；转基因；sck基因；bt基因abstractthe sugar cane is the most main carbohydrate industrial crop in my country, its productivity will directly affect the size of national economic income/stable development , but in actual sugarcane production process, various insect violations will greatly reduce the sugarcane yield and quality, in many of the insect pest, common cane cane is stemborer and one of the most important pests. this research is to modify cowpea trypsin inhibitor sck gene and gene roc16 sugarcane bt germplasm.the exploration obtained the agricultural bacillus to lie between leads the roc16 transgene research the related scientific data: induction sugar cane roc16 injuries the organization the best 2,4-d density is 2.5mg/l (inductivity is 91.7%), roc16 between callus because 2,4-d high concentration and easily induced bud points actual injuries in the induction, has used 1mg/l (inductivity is 72.9%). using 2mg/l 6 - ba + 1mg/l kt/car on 200mg + high concentrations of bud differentiation medium induced stimulus for 15 days, again into 0.5 mg/l 6 - ba + 0.25 mg/l kt 200mg + / car of low concentration medium for 15 days, finally 1mg/l to 6 - ba + 0.5 mg/l kt 200mg + / car medium continuous differentiation. roc16 can solve in conventional concentration (1mg/l 6 - ba + 0.5 mg/l kt/car) 200mg + to induce bud differentiation question.but after roc16 genetic transformation to provide the scientific basis.key words: sugarcane, roc16, agrobacterium-mediated, transgenic, sck gene, bt gene目录1前言11.1甘蔗概况11.2甘蔗遗传转化国内外研究进展12材料与方法32.1材料32.1.1植物材料32.1.2菌种和质粒32.1.3试剂32.1.4主要仪器设备32.2方法32.2.1技术路线32.2.2 cpti基因的修饰42.2.3植物表达载体的构建42.2.4农杆菌介导法转化甘蔗42.2.5愈伤组织的获得和分化53结果与分析73.1 ms1培养基中2,4-d浓度梯度试验结果73.2分化培养结果73.3转基因抗性植株的筛选84讨论94.1外植体的选择94.2外植体的切割94.3菌液浓度的控制94.4乙酰丁香酮（as）的影响94.5筛选105结论11参考文献12致谢13附录14红河学院本科毕业论文 (设计)1.前言1.1 甘蔗概况甘蔗(saccharum officenarum l.)属于禾本科(poaceae)甘蔗属(saccharum)，生长于热带和亚热带地区。中国种植甘蔗已有3000多年历史，是我国制糖的主要原料。我国甘蔗种植面积居于世界第三位，仅次于巴西和印度。目前，我国有359家糖厂，07/08榨季我国食糖总产量1484.11万吨，其中甘蔗糖厂340家，甘蔗糖为1368万吨，所占比例高达92.2%。主要分布在广西、云南、广东、海南、福建等13个省区1。甘蔗中含有丰富的糖分、水分及各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质，是人们日常生活所必不可少的调味品，同时也是机体最重要的供能物质。甘蔗除了是重要的制糖原料外，还是重要的能源物质，蔗糖可以通过微生物发酵技术生产酒精，也可以通过化工技术获得工业酒精。随着石油的快速枯竭，世界各国都在努力寻找新型可再生能源。因此，采用甘蔗来生产酒精是可再生的清洁能源物质，可以替代石油燃烧，并且不污染环境。1.2 甘蔗遗传转化国内外研究进展甘蔗是我国最主要的糖类经济作物，其生产率的大小将直接影响到蔗农的收入和国民经济的稳定发展。但是在实际的甘蔗生产过程中，各种病虫害的侵害将大大降低甘蔗的产量和品质。甘蔗生长过程中会受到鳞翅目和同翅目等多种害虫的危害，在众多的病虫害中，常见的甘蔗害虫是甘蔗螟虫（piatraea saacharalis f.）。化学农药防除害虫成本高和环境污染重。将抗虫基因转入甘蔗，由其自身合成抗虫或杀虫物质防除害虫，特别是针对能源甘蔗的抗虫转基因育种，由于不存在食用安全性问题，具有重大的经济与环境效益2。能获得真正的抗虫转基因甘蔗植株，并使抗虫基因能够高效表达和稳定遗传。主要用于甘蔗遗传转化的抗虫基因由苏云金杆菌毒蛋白基因(简称bt基因)、蛋白酶抑制剂基因及雪花莲凝集素(gna)基因。1997年arencibia用电激法将camv35s 启动子驱动下的来自btkd-1(bacillus thuringiensis var. kurstaki hd-1)的cryia(b)杀虫毒蛋白基因的2.05 kb n 末端片段转化甘蔗，转基因甘蔗对小蔗螟幼虫表现出很高的杀虫活性3。1998年arencibia又用农杆菌转化法获得了转bt基因植株4。2001年braga等将bt基因转入甘蔗获得了对螟虫有抗性的转化植株5。2006年weng用伴随甘蔗模式密码子的人工合成cryiac基因(s-cryiac)，在玉米泛素启动子驱动下，经微1前言弹轰击导入甘蔗yt79-177和roc16的胚状体愈伤组织，免疫分析确定有18个转基因株系表达s-cryiac，饲喂于其上的蛀茎虫一周内全部死亡，而对照品种的叶茎则遭受严重虫害5。falco and silva-filco 采用基因枪法将大豆孔尼兹胰岛素抑制剂(skti)和包曼-布锐克抑制剂(sbbi)基因在ubi-l启动子的驱动下导入甘蔗基因组并得到表达，获得了可在一定程度上抵抗甘蔗钻心虫的转基因植株，田间抗性不甚理想，钻心虫仍能对其产生危害7。2002年setamou等将ubi-gna 导入甘蔗cp65-457 中，在用其叶子喂养墨西哥稻螟的抗虫试验中，幼虫存活率、成虫率、雌虫产卵力均比对照明显下降，这表明gna对墨西哥稻螟的抗性是全面的，但该转基因甘蔗并未从根本上控制害虫的发生8。国内陈平华等9、长孙东亭等10利用基因枪法将外源抗虫基因gna导入甘蔗，获得了一批经初步检测为阳性的再生植株。1998年enriquez-obregon等将携带bar基因的c58c1菌株感染甘蔗分生组织切片，获得10-30的转化率11。1998年arencibia等首次以eha101与甘蔗悬浮培养愈伤组织共培养获得gus及southern检测阳性植株4。1998年elliott等用带有荧光的蛋白(gfp)基因的aglo转化甘蔗胚性愈伤组织获得gfp表达及外源基因整合的转化植株12。在我国，最早用农杆菌介导法的是陈如凯13，但其最终只得到含kan的愈伤组织，并未得到苗。王自章等以根癌农杆菌eha105菌株介导将海藻糖合酶基因遗传转化甘蔗胚性愈伤组织，得到93株抗性植株，经检测有3株呈阳性，这是国内首次获得转化基因菌株14,15。在国内外的甘蔗相关转基因研究中，对于roc22的转基因研究技术比较成熟，而对于roc16的研究比较少，并且只做到roc16的愈伤组织诱导。并没有较为成熟的roc16转基因技术，本论文将对roc16的愈伤组织诱导及芽体的诱导进行研究，获得较高的愈伤组织诱导率，解决roc16芽体分化较难的问题，从而提高转基因率。2红河学院本科毕业论文 (设计)2.材料与方法2.1 材料2.1.1 植物材料实验所选用的材料采自云南省农科院甘蔗研究所种植的云南主栽品种roc16。已在大田生长6个月。2.1.2 菌种和质粒根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)菌株lba4404，由中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯实验室提供。潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase, hpt)基因hpt为植物选择标记基因，构建植物表达载体pcdmarusck-hpt，转化农杆菌lba4404，附kan和str的lb平板培养基上筛选获得工程菌单菌落。2.1.3 试剂卡那霉素(kan)、乙酰丁香酮(as)、链霉素(str)、潮霉素(hyg)、羧苄青霉素(car)、头孢霉素(cef)等均购自云科生物工程公司，6-ba、kt琼脂糖、低熔点琼脂糖分别购自sigma公司，尼龙膜(nc膜)为lkb公司产品，其它常规化学试剂均为国产分析纯试剂。2.1.4 主要仪器设备超净工作台、光照培养箱、-20低温冰箱(siemens)、立式自动电热压力蒸汽锅、高压灭菌锅、紫外可见光分光光度计、dna和rna电泳设备、人工气候箱、恒温摇床、电子天平、显微镜、电磁炉、大型台式冷冻离心机等。2.2 方法2.2.1 技术路线 首先甘蔗胚性愈伤组织的获得，其次农杆菌介导法转化甘蔗胚性愈伤组织，再次是转化植株(诱导分化)培养，最后是转化子的筛选和培养。.2.2 cpti基因的修饰 cpti 基因作为外源基因表达时，在胞浆中易受其他类型蛋白酶的作用而降解 。为提高植物抗虫水平，采用三引物pcr技术进行细胞内定位修饰,在cpti基因5末端和3末端增加了信号肽和内质网定位信号的编码序列，获得了修饰基因sck 。修饰的cpti蛋白在n端加了25个氨基酸的内质网定位信号，c端加了内质网滞留信号kdel。在转基因植株的细胞内，n端的信号肽序列可以将新3材料与方法合成的抗虫融合蛋白引入到内质网，信号肽被细胞内的识别机制识别并被切除。外源抗虫蛋白(cpti)被双层脂质膜包裹，处于细胞的惰性环境中，避免了在细胞胞浆中快速降解 。2.2.3 植物表达载体的构建该载体（图1）在两个mar序列之间连上了一个经过修饰的sck基因和bt基因由玉米泛素启动子启动。图1. 农杆菌中所含的表达载体示意图2.2.4 农杆菌介导法转化甘蔗采集甘蔗时，最佳的时期是6-8月，部位为幼嫩叶鞘16。采集好后，剥去外部叶片，用75%的酒精擦拭表面，在无菌条件下剥去外层，留取幼嫩叶鞘，切成薄片状，接于ms1培养基上：ms+2,4-d1 mol/l+蔗糖30 g/l+琼脂7 g/l+活性炭0.5 g/l ph 5.8，置于散射光下，26-28培养20-25天。外植体培养采用梯度试验选择出最佳诱导浓度，2,4-d浓度梯度设置4红河学院本科毕业论文 (设计)0.5、1、1.5、2和2.5 mg/l 5个梯度。每个处理18片左右外植体，重复3皿。然后计算5个浓度下roc16愈伤组织的生长率和褐化率，计算公式：生长率= 长出胚性愈伤组织的外植体数/接种外植体数100%。2.2.5 愈伤组织的获得和分化将得到的胚性愈伤组织挑出后，转移到活化培养基上：ms+2, 4-d 1 mol/l+蔗糖30 g/l+琼脂7 g/l ph5.8，28活化培养4天左右，取出后，在无菌条件下进行吹干处理。挑取单孢农杆菌至yep液体培养基中，添加kan(50 mg/l)和str(25 mg/l)，于两天前28黑暗条件下200 r/min振荡培养100ml锥形瓶菌体，检测检测yep培养基在od600条件下的菌液浓度为0.614，接着吸取1ml转摇到8个锥形瓶含有200 ml的yep培养基中约18h，在od600条件下的菌液浓度分别为0.414、0.386、0.442、0.412、0.498、0.470、0.503和0.476。取出菌液于离心管中，5000 rpm，离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于等体积的添加了200 mol/las的mr液体培养基中：1/5ms大量元素+ms其它成分+2, 4-d1 mg/l+l0 mmol/l果糖+10 mmol/l葡萄糖+30 g/l蔗糖ph5.3，侵染已经在超净台中做过吹干处理的愈伤组织。侵染时间设定为30 min。侵染后用漏勺滤去菌液于超净台上晾干30分钟左右，转至含有200 mol/las的共培养培养基上：ms+2, 4-d1 mol/l+蔗糖30 g/l+琼脂7 g/l ph5.8，21暗培养4天左右后转至分化培养基中：ms+6-ba1 mg/l+kt0.5 mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7 mg/l ph5.8，抑制农杆菌生长的同时诱导芽的分化，在分化培养基中，添加了car500 mg/l。28光下培养，三周左右浸染过的胚性愈伤组织便能分化出小苗，期间需要经常剔除褐化和被农杆菌严重污染的组织块。由于roc16愈伤组织会因2，4-d浓度过高而不易诱导芽分化，一直采用1mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car培养基进行诱导分化培养，无法使其分化出芽。于是进行以下试验设计：先采用2 mg/l 6-ba+1 mg/l kt+200 mg/l car进行芽的高浓度培养基中诱导刺激分化15天，再转入0.5 mg/l 6-ba+0.25 mg/l kt+200 mg/l car的低浓度培养基中15天，最后转入1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200mg/l car培养基中持续分化。设置实验组3皿，每皿诱导愈伤组织20枚。并且用持续使用1mg/l 6-ba+0.5mg/l kt+200mg/l car培养基进行诱导分化培养5材料与方法作为对照。设置对照组3皿，每皿诱导愈伤组织20枚。本实验采用的是获得小苗后再进行潮霉素筛选，即小苗长到3-4 cm高时，在超净台内选取分化较好、生长健壮的甘蔗分化苗进行分株，于抗性筛选培养基：ms+6-ba1 mg/l+蔗糖30 g/l+琼脂7 mg/l ph 5.8内筛选，培养基中添加浓度为50 mg/l的潮霉素。置于28培养室中培养。6红河学院本科毕业论文 (设计)3.结果与分析3.1 ms1培养基中2,4-d浓度梯度试验结果从5个浓度的2,4-d梯度中，分别挑选一皿愈伤组织来作比较。图2反映的是处于5个梯度中的愈伤组织长势情况。图2. 不同浓度2，4-d诱导roc16愈伤组织照片a. 0.5 mg/ l；b. 1 mg/ l；c. 1.5 mg/ l；d. 2 mg/ l；e. 2.5 mg/ l表1不同2,4-d浓度诱导愈伤组织统计结果处理外植体数2,4-d浓度(mg/l)愈伤组织数生长率(%)平均生长率(%)褐化数褐化率(%)平均褐化率(%)1616160.576443.837.525.035.49101256.362.57564.51616161.010121362.575.081.272.964337.52518.827.11616161.511121468.875.087.577.154231.22512.522.9iv1616162.012141175.087.568.877.14252512.531.222.9v1616162.514141687.587.510091.722012.512.508.3在诱导甘蔗胚性愈伤组织时，我们通常采用的激素是2，4-d。不同浓度的2，4-d对甘蔗胚性愈伤组织的诱导率是不同的。在探索诱导roc16的愈伤组织时，我们不仅要获得较高的诱导率外，还要考虑浓度过高后会导致芽体诱导分化困难的问题。在实验过程中诱导甘蔗roc16愈伤组织的最佳2，4-d浓度为2.5mg/l（诱导率为91.7%），为避免芽体诱导分化困难，在实际的愈伤诱导中，采用了1 mg/l（诱导率为72.9%）。3.2 分化培养结果介于roc16在1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car的分化培养基中持续7结果与分析分化30 d后，并无分化迹象，愈伤组织长势越来越多，未见分化出芽体。所以改用高低中浓度的分化培养基来进行诱导分化。表2 roc16芽体诱导统计结果处理愈伤组织数分化出芽体愈伤数分化率(%)平均分化率(%)高低中18181817161494.488.977.887.0*中等浓75.633.318.5注：“*” 为极显著（p0.01）通过做成组数据t检验，由表2可以看出在中等浓度的分化培养基中持续分化的平均分化率相当低，而在高低中浓度的培养基中进行高低浓度诱导培养，可以极显著提高平均分化率。而且由实验证明，在进行农杆菌介导的roc16转基因过程中，使用该方法可以提高分化率。3.3 转基因抗性植株的筛选将经过转基因和高低中浓度诱导后，获得了一些甘蔗小苗和还在分化的芽体，将已经分化出的小苗挑选出来接入到壮苗培养基中壮苗，而把仍旧在分化的芽体继续转接到分化培养基中培养。通过壮苗培养后，获得比较健壮的roc16甘蔗小苗169株，接入到含有50mg/l的潮霉素筛选培养基中筛选（图3）。在对照组中，未经过转基因过程的小苗处于50mg/ l的潮霉素中时已经全部褐化，实验组还有小部分还在继续生长，经过筛选后存活的小苗将做进一步的实验鉴定。图3.抗性植株的潮霉素筛选 a对照组 b实验组8红河学院本科毕业论文 (设计)4. 讨论4.1 外植体的选择甘蔗幼嫩叶鞘是分化频率较高的部位。最佳的采集时期是6-8月，大于8个月之后的材料就会太老，尽量不要作为诱导愈伤组织的外植体。因为这样诱导的愈伤组织活性不高，愈伤组织周围会产生一圈褐化带，容易在转基因过程中死亡或不分化，从而降低了诱导率。本研究所使用的甘蔗外植体只在最初采集时用酒精擦拭表面，剥离后并未用升汞或者酒精消毒，操作简单，污染率低，诱导出的愈伤长势较好，生长率较高。4.2 外植体的切割取甘蔗幼嫩叶鞘用刀片切割后诱导培养时，所切外植体要足够薄并且一定要完整，这样既可以节省材料，又容易诱导出愈伤组织。在超净台上切割时动作要快，将外植体转移到培养基中时动作也要快，避免外植体被吹干及污染，造成浪费及影响诱导率。在实验中经常会因为所切的外植体厚度不一而影响分化率。也会因为切的不完整而增加褐化率。4.3 菌液浓度的控制在制备农杆菌菌液时把握好培养时间非常重要，在接近所需浓度时，应该提前进行浓度测验，避免超高。菌液浓度过低或过高都不利于侵染，菌液浓度过低，证明农杆菌量不足，侵染时农杆菌附着在植物细胞上的数量就少，影响转化效率；农杆菌浓度过高，由于菌的毒害作用或生长过快等导致植物材料的坏死，从而也降低了转化效率。在实验中我们发现要准确控制好菌液浓度是非常困难的，其影响菌液浓度的因素实在太多，就是同一浓度的菌液转摇到同等体积的相同培养基中，在相同时间的转摇过程后，所获得的菌液浓度也会出入很大。4.4乙酰丁香酮（as）的影响as对农杆菌转化能力有明显的影响，可增加农杆菌在培养植物细胞的附着，提高转化效率。不加入as的农杆菌侵染液，其转化率几乎为零，可见as对转化效率的影响是相当大的。as主要是可以诱导农杆菌vir基因的活化，进一步激活vir区基因的表达，vir基因的表达控制着t-dna的转移。在转化中添加乙酰丁香酮是农杆菌介导的甘蔗转化率提高的至关重要的因素。但是我们在实验过程中发现，添加as对于进行转化的愈伤组织也有一定的毒害作用，加入后会增加愈伤组织的褐化率，也会影响分化。 9讨论4.5 筛选抗性植株的筛选可以分为两种。一种是在诱导芽体的分化培养基中就开始加入潮霉素，直到筛选出抗性苗。这种方法效率比较高，工作量小，费用昂贵。另一种是在诱导出苗后才加入潮霉素进行筛选。此方法工作量大，所需费用少。我们在实验过程中发现，在做roc16的转基因研究时，为了要保证愈伤组织能诱导出更多的小苗，可以降低2，4-d的浓度，寻找0.5 mg/l-1 mg/l之间的适当值作为诱导参数。这样降低了2，4-d在愈伤组织块中的含量，可以使芽体分化率提高，但是降低了愈伤组织的芽体诱导率。当然，农杆菌介导法也存在一些不足之处，最大的问题是农杆菌对单子叶植物特别是禾本科植物不敏感，从而限制了它的适用范围。同时，农杆菌介导遗传转化能否取得成功对基因型的依赖性也比较强。由于农杆菌是一个生物有机体，因此其功能受环境及其作用对象的影响要比其它理化方法复杂得多。10红河学院本科毕业论文 (设计)5.结论在本实验中，使用不同浓度的2，4-d进行roc16愈伤组织诱导过程中，获得的最佳2，4-d浓度为2.5 mg/l（诱导率为91.7%）。但是选用高浓度的2,4-d会使愈伤组织中含有过多的2，4-d，将不利于后期芽体的诱导分化。选用2，4-d浓度为1 mg/l（诱导率为72.9%），虽然诱导率不高，但是便于后期芽体分化，适合作roc16的转基因研究愈伤诱导浓度。在诱导roc16芽体分化的试验中，采用高浓度（2 mg/l 6-ba+1 mg/l kt+200 mg/l car）低浓度（0.5 mg/l 6-ba+0.25 mg/l kt+200 mg/l car）中浓度（1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car）的激素诱导时，roc16愈伤组织芽体分化率为87%，比对照组分化率18.5%高出68.5%。可以及显著地提高甘蔗roc16芽体诱导分化率。11参考文献1 周普国,中国蔗糖业生产与发展策略.中国糖网.2005,2(6):12-152 张显勇,杨本鹏,张树珍.甘蔗转基因研究进展j.分子植物育种.2007,5(6):155-1593 陈如凯,林俊扬,林俊芳等.农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究j.甘蔗. 1996,3(3):1-44 王自章，张树珍，罗敬萍等.甘蔗根癌农杆菌介导遗传转化的研究j.农业生物技术学报. 2002,10(3):237-2405 王自章,张树珍,杨本鹏等.甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株j.中国农业科学. 2003,36(2):140-1466 罗敬萍,张树珍,杨本鹏.农杆菌介导甘蔗基因转化技术的优化j.热带作物学报 .2003,12(14):24-287 罗素兰,长孙东亭,陈如凯.甘蔗遗传转化研究进展j.生物技术通报.2003,2(14):9-138 李瑞美，郑回勇，陈永快等.根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究j.江西农业学报.2006,18(2):22-259 antonelli n m, stadle j. genomic dna can be used with cation methods for highly efficient transformation of maize protoplastsj. theor appl genet. 1996. 80(3):93-9910 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