生物化学2 第8章核酸生物合成讲义

第第 8 8 章章 核酸的生物合成核酸的生物合成 讲义讲义 第一节第一节 DNADNA 的生物合成（复制）的生物合成（复制） 基本要求：基本要求： 1.掌握与 DNA 复制、DNA 损伤与修复、逆转录过程有关的基本概念。包括：半保留复制， 半不连续复制，复制叉，复制子，岡崎片段，领头链，随从链、 （端粒，端粒酶）等。 2.掌握复制的过程，以及复制过程中涉及到的各种酶、蛋白因子；并掌握原核生物与真核 生物复制的相同点与不同点。 3.掌握逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用。 4.了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。 重点：重点：DNA 分子在生物体内的合成有三种方式：（1）DNA 指导的 DNA 合成，也称复制，是 细胞内 DNA 最主要的合成方式。遗传信息储存在 DNA 分子中，细胞增殖时，DNA 通过复制 使遗传信息从亲代传递到子代。（2）修复合成，即 DNA 受到损伤（突变）后进行修复，需 要进行局部的 DNA 的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传。（3）RNA 指导的 DNA 合成，即 反转录合成，是 RNA 病毒的复制形式，以 RNA 为模板，由逆转录酶催化合成 DNA。真核生 物的 DNA 合成过程与原核生物基本相似，但机理尚不十分清楚，以原核生物为例介绍其复 制过程。 难点：DNA 的双螺旋结构是复制的结构基础。DNA 复制的实质为酶催化的脱氧核糖核苷酸的 聚合反应。复制开始时，亲代双链 DNA 分子解开，分别作为模板，在 DNA 依赖的 DNA 聚合 酶催化下，按照碱基配对的原则，将四种脱氧核苷酸连接成 DNA 大分子，合成产物的碱基 序列与模板 DNA 的碱基序列是互补的，子代 DNA 双链分子中，一条来自亲代的模板链，另 一条为新合成的链，故称半保留复制，是生物体最主要的 DNA 合成方式；合成过程中，自 53连续合成一条领头链，不连续地合成一些片断，而后连成一条随从链，所以 DNA 合成是半不连续合成。反应过程复杂，首先螺旋松弛，双链打开，形成复制叉，然后复制 的引发，包括合成引物，形成引发体，最后是 DNA 链的延长与终止。每一阶段需要有许多 酶和蛋白因子参与，包括拓扑异构酶，用于理顺解链过程中造成的链的盘绕、打结等现象； 解螺旋酶在蛋白因子的辅助下结合于复制起始点，并打开双链，由单链结合蛋白稳定解开 的两股单链；引物酶及其它辅助蛋白因子在打开的双链上催化合成引物，由引物提供 3- OH，与原料 dNTP 的 5-P 形成磷酸二酯键，然后 DNA 聚合酶催化这一聚合反应的进行，而 DNA 连接酶将复制中的不连续片段连接成完整的链。真核生物的复制与原核生物相比，为 多个起始点、5 种 DNA 聚合酶以及有端粒复制等特点。 一、DNA 的复制 基本要求： 1.掌握复制叉、半不连续复制、岡崎片段、领头链、随从链等基本概念。 2.掌握拓扑异构酶、解螺旋酶、单链结合蛋白、引物酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶的特点及 生物学作用。 3.熟悉 DNA 的合成过程。 4.了解半保留复制的实验依据。 基本概念： 1.中心法则：遗传信息从 DNA 通过转录流向 RNA，RNA 通过翻译指导合成蛋白质，这种遗传 信息的传递规律称之。少数 RNA 也是遗传信息的贮存者，RNA 能逆转录为 DNA，是对中心法 则的补充。 2.复制（replication）：即 DNA 的生物合成，以 DNA 为模板指导合成相同的 DNA 分子，使 遗传信息从亲代传递到子代的过程。RNA 病毒的遗传信息储存于 RNA 分子中，可进行 RNA 复制并反转录合成 DNA。 3.半保留复制（semiconservative replication）：DNA 复制时，亲代 DNA 双螺旋结构解 开，分别以解开的两股单链为模板，以 dNTP(dATP、 dGTP 、dTTP 、dCTP)为原料，按照 碱基互补的原则，合成与模板链互补的新链，从而形成两个子代 DNA 双链，其结构与亲代 DNA 双链完全一致。因子代 DNA 双链中的一股单链源自亲代，另一股单链为合成的新链， 形成的双链与亲代双链的碱基序列完全一致，故称为半保留复制。 4.复制叉（replication fork）：原核生物 DNA 的复制从单一起点开始，双螺旋结构被打 开，分开的两股单链分别作为新 DNA 合成的模板，DNA 合成从起点开始向两个方向进行， 与单一起点相连的局部结构形状呈“Y”型，称复制叉结构。 5.半不连续复制：复制过程中，催化 DNA 合成的 DNA 聚合酶只能催化核苷酸从 53方 向合成，以 3 5链为模板时，新生的 DNA 以 53方向连续合成；而以 53 为模板只能合成若干反向互补的岡崎片段，这些片段再相连成完整的新链，故称半不连续 复制。 6.岡崎片段（Okazaki fragments）：DNA 双链是反向平行的，复制时，亲代双链 DNA 在复 制叉处打开，由于新链的合成具有方向性，即从 53，以 53DNA 链为模板合成 反向互补的新链时，只能合成小片段 DNA，这些片段根据发现者命名为岡崎片断。 7.领头链、随从链：DNA 双链是反向的，复制时，两股链均作为模板，但新链的合成只能 是 53。因此，顺着解链方向合成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链， 另一股新链的复制方向与解链方向相反，复制是不连续进行的，这条不连续合成的链称为 随从链。 8.引发体：是由 DnaA 蛋白、DnaB 蛋白（解螺旋酶）、DnaC 蛋白、引物酶和 DNA 的起始复 制区域共同形成的一个复合结构。DnaA 蛋白辨认复制起始点，DnaB 蛋白有解螺旋作用， DnaC 蛋白使 DnaB 蛋白组装到复制起始点，引物酶合成引物。 （一）、原核生物 DNA 的复制 1与复制有关的酶及蛋白质： （1）拓扑异构酶：通过切断并连接 DNA 双链中的一股或双股，改变 DNA 分子拓扑构象，避 免 DNA 分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。其种类有：拓扑异构酶 I 和拓 扑异构酶 II，拓扑异构酶 I 能切断 DNA 双链中一股并再连接断端，反应不需 ATP 供能；拓 扑异构酶 II 能使 DNA 双链同时发生断裂和再连接，需 ATP 供能，并使 DNA 分子进入负超螺 旋。 （2）解螺旋酶： DNA 进行复制时，需亲代 DNA 的双链分别作模板来指导子代 DNA 分子的 合成，解螺旋酶可以将 DNA 双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为 DnaB。 （3）单链结合蛋白（SSB）：在复制中模板需处于单链状态，SSB 可以模板的单链状态并 保护模板不受核酸酶的降解。随着 DNA 双链的不断解开，SSB 能不断的与之结合、解离。 （4）引物酶： 是一种 RNA 聚合酶，在复制的起始点处以 DNA 为模板，催化合成一小段 互补的 RNA。DNA 聚合酶不能催化两个游离的 dNTP 聚合反应，若没有引物就不能起始 DNA 合成。引物酶能直接在单链 DNA 模板上催化游离的 NTP 合成一小段 RNA，并由这一小段 RNA 引物提供 3-OH， 经 DNA 聚合酶催化链的延伸。 （5）DNA 聚合酶：是依赖 DNA 的 DNA 聚合酶，简称为 DNA pol，以 DNA 为模板，dNTP 为原 料，催化脱氧核苷酸加到引物或 DNA 链的 3-OH 末端，合成互补的 DNA 新链，即 5 3聚合活性。原核生物的 DNA 聚合酶有 DNA polI、DNA pol II 和 DNA pol III，DNA pol III 是复制延长中真正起催化作用的，除具有 53聚合活性， 还有 3 5 核酸外切酶活性和碱基选择功能，能够识别错配的碱基并切除，起即时校 读的作用；DNA pol I 具有 53聚合活性、3 5和 53核酸外切酶活性， 53核酸外切酶活性可用于切除引物以及突变片段，起切除、修复作用。另外， klenow 片断是 DNA pol I 体外经蛋白酶水解后产生的大片段，具有 DNA 聚合酶和 3 5外切酶活性，是分子生物学的常用工具酶。DNA pol II 在无 DNA pol I 和 DNA pol III 时起作用，也具有 53和 3 5 核酸外切酶活性。 （6）DNA 连接酶：DNA 连接酶用于连接双链中的单链缺口，使相邻两个 DNA 片段的 3-OH 末端和 5-P 末端形成 3,5磷酸二酯键。DNA 连接酶在 DNA 复制、修复、重组、剪接中 用于缝合缺口，是基因工程的重要工具酶。 2DNA 的合成过程：可将复制过程分为起始、延长和终止三个阶段。 复制起始： （1）辨认起始点，合成引发体：在 E.coli，复制起始点称为 oriC，具有特定结构能够被 DnaA 蛋白辨认结合，DnaB 蛋白具有解螺旋作用，DnaC 蛋白使 DnaB 蛋白结合于起始点， DNA 双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体。 （2）形成单链：DNA 进行复制时，首先在拓扑异构酶作用下，使分子的超螺旋构象变化， 然后在解链酶的作用下，解开双链，才能开始进行 DNA 的合成。解螺旋酶在蛋白因子的辅 助下打开 DNA 双链，单链结合蛋白 SSB 结合于处于单链状态模板链上；拓扑异构酶使 DNA 分子避免打结、缠绕等，在复制全过程中起作用。 （3）合成引物：引发体中的引物酶催化合成 RNA 引物，由引物提供 3-OH 基，使复制开 始进行。领头连和随从链均由引物酶合成引物，随从链在复制中需多次合成引物。 复制延长： （1）复制方向：原核生物如 E.coli，只有一个起始点 oriC，两个复制叉同时向两个方向 进行复制，称为双向复制。 （2）链的延长：按照与模板链碱基配对的原则，在 DNA 聚合酶 III 的作用下，逐个加入脱 氧核糖核酸，使链延长。由于 DNA 双链走向相反，DNA 聚合酶只能催化核苷酸从 53 方向合成，领头链的复制方向与解链方向一致，可以连续复制，而另一股模板链沿 5 3方向解开，随从链的复制方向与解链方向相反，复制只能在模板链解开一定长度后进 行，因此随从链的合成是不连续的，形成的是若干个岡崎片段。DNA 聚合酶 I 的即时校读， DNA 聚合酶 III 的碱基选择功能，使复制具有保真性。 复制终止： 原核生物如 E.coli，他的两个复制叉的汇合点就是复制的终点。由 RNA 酶切去领头链和随 从链中的引物，引物留下的空隙由 DNA 聚合酶 I 催化，四种脱氧核糖三磷酸为原料自 5 3方向延长填补。最后，DNA 连接酶由 ATP 供能，将两个不连续片段相邻的 5-P 和 3-OH 连接起来，成为连续的子链，复制完成。 （二）、真核生物的复制*： 真核细胞的一生可以定义为一个细胞周期，细胞增殖时，DNA 通过复制使其含量成倍增加， 随后细胞分裂，成为两个子代细胞，DNA 将亲代的特征传递到子代。细胞周期包括 G1 期、 S 期、G2 期和 M 期，DNA 的复制只发生在 S 期。与原核生物相比，真核生物的复制具有以 下特点： 1.多复制子：真核生物的 DNA 复制也是半保留复制。染色体线性分子的复制有多个起始点， 每个起始点由两个反向运动的复制叉组成，进行双向复制。由一个起始点控制的 DNA 复制 称为一个复制子。 2.5 种 DNA 聚合酶：与原核生物不同，真核细胞含有 5 种 DNA 聚合酶：、 和 。除了 外，所有 DNA 聚合酶存在于核内。DNA 聚合酶 和 在复制延长中起催化作 用，DNA 聚合酶 延长随从链，DNA 聚合酶 延长领头链。DNA 聚合酶 和 在复制过 程中起校读、修复和填补缺口的作用。DNA 聚合酶 在线粒体中，用于线粒体 DNA 的复制。 3.端粒复制：真核生物染色体线性分子的复制，领头链可连续完整复制，而随从链 3端 引物除去后的空隙无法填补，会造成缩短了的子代的双链，解决的途径是用端粒酶来复制 染色体的末端（端粒）。端粒是染色体末端具有特定重复序列和蛋白质的结构，端粒酶是 一种逆转录酶，由酶和含重复序列的 RNA 分子组成，它以自身的 RNA 分子为模板从随从链 的 3端合成端粒的重复序列，使随从链延长，以防止随从链在每次复制时被缩短。 二、DNA 的修复合成* 受环境理化因素或生物学因素的影响，DNA 序列会发生改变，包括碱基的变化、链的断裂、 交联等，通过一定的修复机制对损伤 DNA 进行校正，保证遗传信息的稳定。 基本要求： 1掌握 DNA 突变的概念及突变类型。 2掌握损伤 DNA 的修复机制。 3了解突变的意义及引起突变的因素。 4了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。 基本概念： 1突变：是指 DNA 分子中碱基序列的改变，从而影响其表达产物的结构与功能。 2框移突变：基因编码区域插入或缺失碱基，DNA 分子三联体密码的阅读方式改变，使转 录翻译出的氨基酸排列顺序发生改变，称为框移突变。3 个或 3n 个碱基插入或缺失，不一 定引起框移突变。 3切除修复：是最重要的修复方式，由 UvrA、UvrB、UvrC、DNA-pol I、dNTP、连接酶参 与。首先 UvrA、UvrB 辨认损伤部位并与之结合，UvrC 切除损伤的 DNA，DNA-pol I 以 dNTP 为原料，填补切除空隙，最后由连接酶连接缺口，完成修复。 （一）突变类型： 1点突变：又称错配。DNA 分子中一个碱基的变异，包括转换和颠换。 2缺失：DNA 分子中一个核苷酸或一段核苷酸的消失。 3插入：一个核苷酸或一段核苷酸插入到 DNA 分子中。 4重排：DNA 链内部重组，使其中一段方向反置或大片段的链在 DNA 分子内迁移。 （二）修复方式： 1直接修复：又称光修复，由光修复酶修复因紫外照射引起的嘧啶二聚体，使其还原。 2切除修复：见上。 3重组修复：当损伤的 DNA 尚未进行修复就已经进行复制，复制出的子代 DNA 会出现缺口， 此时所产生的子代 DNA 就需进行重组修复。重组蛋白 RecA 具有核酸酶活性，将健康母链中 与缺口对应的一股 DNA 片段重组到子链缺口处，而健康母链出现的缺口，可按健康的模板 由 DNA 聚合酶催化填补，然后由连接酶连接，最后将健康链完全复原。 4SOS 修复：是 DNA 损伤到难以继续复制时，细胞采取的一种应急性修复方式。DNA 损伤 严重，诱导出一系列的复杂反应，产生 SOS 修复酶系，包括重组蛋白、调控蛋白以及复制、 修复的酶系统等。 三、DNA 的反转录合成 反转录又称逆转录，指遗传信息从 RNA 流向 DNA。是 RNA 指导下的 DNA 合成过程，即以 RNA 为模板，四种 dNTP 为原料，合成与 RNA 互补的 DNA 单链，催化这一过程的酶称反转录酶， RNA 病毒中都含有此酶。 1反转录酶：属 RNA 指导的 DNA 聚合酶，具有三种酶活性，即 RNA 指导的 DNA 聚合酶， RNA 酶，DNA 指导的 DNA 聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立 基因文库、获得目的基因等工作。 2合成过程；RNA 为模板，在反转录酶的催化下，合成与 RNA 互补的 DNA 单链，形成杂化 双链，反转录酶将其中 RNA 链水解，在以互补的 DNA 链为模板，合成双链 DNA。 3反转录方向：53。 第二节第二节 RNARNA 的生物合成的生物合成 重点：重点：转录的反应体系，原核生物 RNA 聚合酶和真核生物中的 RNA 聚合酶的特点，RNA 的 转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核 RNA 的转录后加工，包括各种 RNA 前体的加工过程。 难点：转录模板的不对称性极其命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录 终止，mRNA 前体的剪接机制（套索的形成及剪接） ，第、类和第类内含子的剪接过 程，四膜虫 rRNA 前体的加工，核酶的作用机理。 一模板和酶 要点： 1模板 RNA 的转录合成需要 DNA 做模板，DNA 双链中只有一股链起模板作用，指导 RNA 合 成的一股 DNA 链称为模板链（template strand） ，与之相对的另一股链为编码链 （coding strand） ，不对称转录有两方面含义:一是 DNA 链上只有部分的区段作为转录模板 (有意义链或模板链),二是模板链并非自始至终位于同一股 DNA 单链上。 2RNA 聚合酶 转录需要 RNA 聚合酶。原核生物的 RNA 聚合酶由多个亚基组成:2 称为核心酶,转录延长只需核心酶即可。2 称为全酶,转录起始前需要 亚基辨 认起始点,所以全酶是转录起始必需的。真核生物 RNA 聚合酶有 RNA-pol、三种, 分别转录 45s-rRNA; mRNA(其前体是 hnRNA);以及 5s-rRNA、snRNA 和 tRNA。 3.模板与酶的辨认结合 转录模板上有被 RNA 聚合酶辨认和结合的位点。在转录起始之前被 RNA 聚合酶结合的 DNA 部位称为启动子。典型的原核生物启动子序列是-35 区的 TTGACA 序列和-10 区的 Pribnow 盒即 TATAAT 序列。真核生物的转录上游调控序列统称为顺式作用元件,主要有 TATA 盒、 、CG 盒、上游活化序列(酵母细胞)、增强子等等。和顺式作用元件结合的蛋白质都有调控 转录的作用,统称为反式作用因子。反式作用因子已发现数百种,能够归类的称为转录因子 (TF),相应于 RNA-pol、的是 TF、TF、TF。TF又有 A、B、C、D、E、F 多 种及其亚类。 基本概念： 1.不对称转录:两重含义,一是指双链 DNA 只有一股单链用作转录模板(模板链);二是对不同 基因同一单链上某些区段作为模板链而另一些区段作为编码链，即模板链并非永远在同一 单链上。 2. 编码链:DNA 双链上不用作转录模板的那一段单链,因其碱基序列除由 T 代替 U 而外,其 他与转录产物 mRNA 序列相同而得名。 3（sigma）因子:原核生物 RNA 聚合酶全酶的成份,功能是辨认转录起始区,这种 因 子称 70,此外还有分子量不同,功能不同的其他 因子。 基本要求： 掌握转录与复制的区别，转录的不对称性，原核生物的 RNA 聚合酶的组成及各 亚基的功能，真核生物 RNA 聚合酶的分类、性质及功能，原核生物启动子的结构特点，了 解真核生物 RNA 聚合酶的组成，研究转录起始区的方法。 二转录过程 1转录起始：转录的起始就是生成由 RNA 聚合酶,模板和转录 5端首位核苷酸组成的起始 复合物。原核生物 RNA5端是嘌呤核苷酸(A、G),而且保留三磷酸核苷的结构,所以其起始 复合物是:pppG-DNA-RNA 聚合酶。 真核生物起始,生成起始前复合物(PIC)。例如 RNA-pol-转录,是由各种 TF相互辨认结 合,再与 RNA 聚合酶结合,并通过 TF 结合到 TATA 盒上. 2. 转录延长: 转录的延长是以首位核苷酸的 3-OH 为基础逐个加人 NTP 即形成磷酸二醋键,使 RNA 逐步从 5向 3端生长的过程。在原核生物,因为没有细胞膜的分隔,转录未完成即已开 始翻译,而且在同一 DNA 模板上同时进行多个转录过程。电镜下看到的羽毛状图形和羽毛上 的小黑点(多聚核糖体),是转录和翻译高效率的直观表现。 3转录终止：转录的终止在原核生物分为依赖 Rho 因子与非依赖 Rho 因子两类。Rho 因子 有 ATP 酶和解螺旋酶两种活性,因此能结合转录产物的 3末端区并使转录停顿及产物 RNA 脱离 DNA 模板。非依赖 Rho 因子的转录终止,其 RNA 产物 3-端往往形成茎环结构,其后又 有一串寡聚 U。茎环结构可使因子聚合酶变构而不再前移,寡聚 U 则有利于 RNA 不再依附 DNA 模板链而脱出。因此无论哪一种转录终止都有 RNA 聚合酶停顿和 RNA 产物脱出这两个 必要过程。真核生物转录终止是和加尾(mRNA 的聚腺昔酸 poly A)修饰同步进行的。 RNA 上的加尾修饰点结构特征是有 AAAUAA 序列。 基本概念： 1转录起始前复合物 (pre-initiation complex,PIC):是真核生物转录因子与 RNA 聚合酶 一同结合于转录起始前的 DNA 区域而成的复合物。 2加尾修饰点：真核生物 mRNA 转录不是在 mRNA 的位置上终止，而是在数百个核苷酸之后， 研究发现在编码链读码框架的 3端之后，常有一组共同序列 AATAAA，再下游还有相当多 GC 的序列，这些序列称为加尾修饰点,转录越过修饰点后，mRNA 在修饰点处被切断，随即 加入 polyA。 3Rho 因子：是原核生物转录终止因子,有 ATP 酶和解螺旋酶活性。转录终止也可不依赖 Rho 因子。 基本要求： 掌握原核生物的转录起始复合物的形成过程，真核生物转录起