生物制品学第7,8,9章部分重点

第七章第七章 基因工程菌苗基因工程菌苗 目前应用菌苗的类别：目前应用菌苗的类别：按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即减毒的活菌苗、灭活的死 菌苗、纯化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合重 组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合菌苗。 理想菌苗的条件：理想菌苗的条件：（1）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌性，无致畸变或致流产性。 （2）结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。 （3）对 各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。 （4）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。 （5）能口服，能有效诱导黏膜免疫。 （6）易于生产，储存及服务，不需冷藏。 传统菌苗对重要细菌感染性疾病存在的问题：传统菌苗对重要细菌感染性疾病存在的问题：现有菌苗保护效果不好；副反应大； 难以培养的细菌；可诱发癌变，有严重后遗症；新出现的病原体或新变异病原菌。 DNA 苗分类：苗分类：1、裸核酸菌苗 2、用减毒的细菌做载体，将重组的 DNA 转化至载体上，再 去转染人或动物细胞 与裸与裸 DNA 释放相比，用细菌释放释放相比，用细菌释放 DNA 的优点的优点： 1）用肌肉注射或基因枪注入 DNA 只能 转染有限的抗原提呈细胞（APCs） ，而通过适当的细菌释放 DNA，能将质粒 DNA 特异靶 向相关免疫组织的 APCs，且除 APCs 外，还可靶向树突状细胞（DCs） ，以能更好地进行 抗原提呈。2）细菌的成份如 G-菌的 LPS 和 G+菌的脂肽酸及细菌 DNA 中没有甲基化的序 列等，都有佐剂活性，可增加释放 DNA 的免疫原性。3）细菌载体还能进行口服，转染肠 相关淋巴组织，促进黏膜免疫效果。他们可停留在吞噬泡中，也可通过分泌溶质膜素破泡 而进入胞浆。控制抗原提呈的途径及相应的 T 细胞亚类的效应反应。 用胞内细菌释放用胞内细菌释放 DNA 系统也存在危险因素：系统也存在危险因素：1）入侵性虽然利于 DNA 释放，也存在毒力 回复的危险。2）G-菌的 LPS 也有毒性问题。3）释放的 DNA 有整合到宿主细胞基因组的 可能。 基因工程菌苗开发战略的几点考虑基因工程菌苗开发战略的几点考虑： 1.创新疫苗的研制，开发和应用 2.对病原体致病与发病机制的认识及宿主抗感染免疫机制 的了解 3.黏膜疫苗及黏膜释放途径是创新疫苗研制的重要方向 4.人类重要病原体基因组测 序的完成，将为创新疫苗的研制提供新的机会和条件 5.创新疫苗的研制需要不同学科的协 作，理论的融合及各类生物技术包括动物模型的合理使用与创建 第八章第八章 基因工程寄生虫疫苗基因工程寄生虫疫苗 对寄生虫疫苗研究成功的关键对寄生虫疫苗研究成功的关键:1、选择免疫应答难以作用的寄生部位； 2、寄生虫在宿主 体内不同发育阶段表现抗原特异性改变，从而使获得性免疫力有严格的阶段特异性。3、寄 生虫在抗原变异，抗原摹拟和寄生虫摄入宿主 DNA 和获得宿主蛋白或以宿主抗原伪装自 己方面也表现出非常复杂而有效的免疫逃避机制。 寄生虫疫苗的分类：寄生虫疫苗的分类：带低毒活野生型疫苗（自然界中分离的） ；致弱病原疫苗（减毒活 疫苗） ；灭活或死病原疫苗；亚单位疫苗（包括抽提物或代谢产物） ；合成的或重组 的抗原疫苗；抗独特型 Ab 疫苗；DNA 疫苗。 迄今仍无公认的寄生虫病疫苗，究其原因：迄今仍无公认的寄生虫病疫苗，究其原因：（1）多数寄生虫为多细胞生物，寄生虫抗原成 分非常复杂，很难找准特定保护性抗原，保护性免疫应答机制不清。 （2）寄生虫抗原免疫 所诱导的大都为部分保护性免疫力（一般为 30%70%） 。 （3）寄生虫形成种种逃避宿主免 疫应答的办法，其机制尚待阐明。 （4）寄生虫一般引起慢性长期感染，病期因寄生虫生活 史中形态上不同，常存在数阶段。 疟疾疫苗的分类：疟疾疫苗的分类： 1、抗红前期原虫疫苗：红前期疟疾疫苗又称抗感染疫苗，主要针对疟原虫子孢子或肝内期 疟原虫，红前期疫苗通过诱导机体产生特异性抗体，来阻止子孢子入侵肝细胞或诱导机体 产生特异性识别感染肝细胞的 T 细胞，来杀死感染肝细胞或干扰疟原虫在肝细胞内的发育 增殖，阻止其释放出感染性裂殖子，从而达到抗感染的效果。抗红前期原虫疫苗达到 100%的 保护率才能真正达到保护效果, 因为只要有单个子孢子逃逸就可能引起机体的感染。 2、抗红内期原虫疫苗：红内期疟疾疫苗又称抗病疫苗，其机制一般是阻断裂殖体入侵红细 胞或避免感染红细胞黏附于血管内皮细胞。裂殖子表面蛋白和顶端复合体抗原成为疫苗研 究的焦点。 3、传播阻断性疫苗：通过阻止疟原虫在蚊虫体内的有性增殖而达到阻断疟疾传播的目的， 在这个过程中，虽然不能使个体免于疟疾感染，也不能减轻症状，但能阻断蚊虫将疟原虫 从一个宿主传播至另一个宿主 ，传播阻断性疫苗候选抗原主要表达于蚊虫阶段疟原虫表面 ，是当前疟疾疫苗研究的热点。雌雄配子、合子和动合子所表达的表面蛋白是研制传播阻 断性疫苗的重要靶抗原。 疟疾疫苗研制的疟疾疫苗研制的 3 个阶段：个阶段：1.第一阶段是减毒疫苗 2.第二阶段是亚单位疫苗 3.第三阶段是 基因疫苗 疟疾疫苗研制所面临的困难和挑战：疟疾疫苗研制所面临的困难和挑战：(1) 缺乏保护作用强的候选抗原。(2)缺乏对疟疾保护 性免疫机制的了解。(3) 缺乏有效的动物模型。(4) 缺乏持久的免疫力和难以产生足够高水 平的抗体。 血吸虫成虫主要寄生于肠系膜下静脉，致病以虫卵为主血吸虫成虫主要寄生于肠系膜下静脉，致病以虫卵为主 血吸虫的主要特点：血吸虫的主要特点：1.成虫似线虫，圆柱形；雌雄异体，但常合抱；2.成虫在血管内（门脉 系统）寄生，虫卵从粪或尿中排出；3.生活史中无雷蚴和囊蚴阶段；4.尾蚴为感染期，经皮 肤感染；5.仅有一个中间宿主：钉螺； 第九章第九章 治疗性抗体治疗性抗体 抗体抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物 质刺激后，B 淋巴细胞活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，统称为免疫球蛋白免疫球蛋白。 抗体分子的生物学功能抗体分子的生物学功能：1. 特异性地结合抗原 2. 活化补体 3. 结合 Fc 受体，产生多种生 物学效应，如（1）介导型变态反应（2）调理吞噬作用（3）发挥抗体依赖的细胞介导的 细胞毒作用（4）通过胎盘 IgG 是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的 Ig （5）结合金 黄色葡萄球菌 A 蛋白（6）具有抗原性 抗体分子的治疗作用：抗体分子的治疗作用：1、在体外诊断上，用于检测各种抗原。2、在肿瘤检测方面，同位 素标记的单克隆抗体可与肿瘤组织表面的抗原结合，起到免疫扫描、免疫成像的作用，优 于超声波和核磁共振。3、在预防方面，抗体主要可用于感染性疾病的预防。 抗体的治疗机制抗体的治疗机制:（1）中和作用：用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。 （2）示踪或导向作用：使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分 子。 （3）竞争性抑制作用/拮抗作用：与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子 作用产生毒性损害。 （4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应及补体依赖性细胞溶解作用 （5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性。 抗体的治疗应用：抗体的治疗应用：（1）抗肿瘤作用（2）抗感染作用（3）抗器官移植排斥反应（4）抗血 栓形成（5）解毒（6）构建抗独特型抗体疫苗（7）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中 的应用 单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应及补体依赖 性细胞溶解作用。单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物 导弹” ，可用于导向治疗。单抗给予 T 细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号 和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒 T 淋巴细胞可用于特异性、被动性的免疫治疗。 抗体的分类：抗体的分类：抗体分为单克隆抗体、多克隆抗体及基因工程抗体三类。 单克隆抗体单克隆抗体：识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称之为单克隆抗体 （第二代抗体） 。其特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少等优点 单抗可以分两种形式单抗可以分两种形式 1、全抗 2、酶解片段，木瓜蛋白酶的水解片段和胃蛋白酶的水解片段 单克隆抗体存在的一些问题：单克隆抗体存在的一些问题： （1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性（2）半衰期短（3）靶 吸收差（4）生产复杂，价格昂贵 在基因水平对抗体分子进行切割、拼接或修饰，甚至人工全合成后导入受体细胞表达，产 生新型抗体，也称第三代抗体第三代抗体。 鼠单克隆抗体的人源化：鼠单克隆抗体的人源化：就是为克服鼠源 McAb 的免疫原性而将其进行改造，使之和人体 内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反 应。 抗体的人源化有两个基本的原则：抗体的人源化有两个基本的原则：保持或提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或消除抗 体的免疫原性。 将鼠 McAb 可变区中相对保守的 FR 按成人的 FR 框架区，仅仅保留抗原结合部位 CDR（即 CDR 移植互补决定区） ，这才是真正意义上的抗体人源化真正意义上的抗体人源化，该种抗体又称为 CDR 移植抗体或改型抗体。移植抗体或改型抗体。 人人-鼠嵌合抗体原理鼠嵌合抗体原理：嵌合抗体的基本原理就是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因 组中分离并鉴定出重排的功能性鼠 IgV 区基因，经基因重组与人 IgC 区基因按一定方式相 拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表 达来制备特异性嵌合抗体。通过构建嵌合抗体，用人 C 区取代鼠 C 区，可以较好解决鼠源 性单克隆抗体诱发 HAMA 等不良反应，延长单克隆抗体的半衰期，改善单克隆抗体的药 物动力学。 抗体与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其抗体与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其 V 区的区的 6 个互补个互补 CDR 区区(互补互补 Ag 决定区决定区)。 小分子抗体可分为小分子抗体可分为 Fab 抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等四种。 特殊类型的基因工程抗体：特殊类型的基因工程抗体：双特异性抗体；免疫黏连素；催化抗体。 有双特异性的抗体分子就称为双特异性抗体双特异性抗体或双功能抗体。 BsAb（双特异性抗体）的作用：抗肿瘤、抗血栓形成、抗感染作用 抗肿瘤：介导活化的 T 淋巴细胞。介导巨噬细胞的肿瘤免疫疗法。除了介导肿瘤细 胞与效应细胞的结合外，BsAb 还可用于向肿瘤细胞输送免疫毒素。BsAb 还用于介导其 他药物的肿瘤杀伤作用。 BsAb 构建法：构建法：化学交联法生物学法（杂种杂交瘤法）基因工程法 免疫黏连素优点：免疫黏连素优点：亲和力强；半衰期长；大大隆低了其工作浓度；减少非特异副 作用及 HAMA 发生率，应用上比亲本单克隆抗体更为安全可靠。 噬菌体抗体库：噬菌体抗体库：利用基因工程的方法将全套人抗体重链和轻链 V 区基因克隆出来，并在噬 菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体，这种技术称为噬菌体抗体库。 噬菌体抗体库基本原理：噬菌体抗体库基本原理：该技术以噬菌体为载体，将抗体基因（Fab 或 ScFv 基因等）与噬 菌体编码的外壳蛋白（CP）或（CP）相连，在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合 蛋白的形式