王小琴省自然基金慢性肾脏病肾虚证的应用基础研究

湖北省自然科学基金计划重点项目建议书湖北省自然科学基金计划重点项目建议书 项目名称：慢性肾脏病肾虚证的应用基础研究项目名称：慢性肾脏病肾虚证的应用基础研究 项目承担单位：湖北省中医院项目承担单位：湖北省中医院 项目建议人：项目建议人： 王小琴王小琴 二二 0000 八年四月八年四月 慢性肾脏病慢性肾脏病“ “肾虚证肾虚证” ”的应用基础研究的应用基础研究 一、面向湖北经济与社会发展需求的科学问题一、面向湖北经济与社会发展需求的科学问题 （一）（一） 、立项背景、立项背景 慢性肾脏病（CKD）是指各种原发或继发病因导致的肾脏结构异常或肾功能下降，持 续时间3 个月者；表现为：肾脏病理异常，肾损害（尿液或血液成分异常，或肾脏影像 学检查异常） ，肾小球滤过率（GFR）正常、增高或下降。 目前对于慢性肾脏病尚无特效的药物疗法，大多呈不可逆进展，最终导致终末期肾病 （ESRD） 。90 年代全球用于终末期肾病的透析费用约为 4500 亿美元，预期新世纪的第一个 十年中将达到万余亿。这个日益增长的经费对于工业发达国家就已成为严重的经济负担， 而占全球人口 20%的发达国家，却占透析人群的 90%，表明广大发展中国家的终末期肾病病 人得不到透析治疗。因此，对慢性肾脏病的防治，已经成为全球性的公共卫生事件 1。 在我国经济不发达地区，由各种感染、免疫介导的肾脏病发病率仍居高不下，另一方 面，在经济发达地区，继发于糖尿病、高血压、高血脂、高血尿酸等代谢性疾病的肾脏损 害发病率也在上升。初步的流行病学调查结果显示，我国成年人群慢性肾脏病的患病率约 为 89，数目令人震惊2。 中医参与的中西医结合综合治疗方案是我院对慢性肾脏病防治方法的重要组成部分， 既往的研究已显示出良好的优势和研究前景。 由于各种慢性肾脏病均以蛋白尿、血尿、水肿为最基本的临床表现，根据中医肾藏象 理论，其发病的机理可以“肾失封藏”和“气化失司”来概括，病变以“肾”为中心，随 着病程的进展，与肺、脾、肝、心等脏腑在病理上相互传变和影响，最终导致五脏（肾、 肺、脾、肝、心）虚损、病邪（水湿、湿热、痰浊、瘀血、尿毒）内盛的局面。在长期的 临床实践中，我科采用以“肾”为本的措施对慢性肾脏病中三大疑难疾病（慢性肾衰竭、 肾病综合征、慢性肾小球肾炎）进行防治，积累了宝贵的经验和理论。在 60 年代初期，我 科就提出先辨病后辨证的中西医结合诊疗模式治疗慢性肾脏病，著治疗慢性肾炎八法 、 治疗慢性肾炎合并尿毒症经验 。对慢性肾炎的辨证，有热伤肾络、肾气不固、肾阴亏虚、 气阴两虚、肾阳虚弱。对肾病综合征的辨证，有风邪扰肾、热毒伤肾、阳虚水泛、肾络瘀 阻、气阴两虚。慢性肾衰竭早、中期以肾气阴两虚为主，晚期为肾阳虚衰、精血亏耗；对 蛋白尿、血尿的辨证以湿热伤肾、肾气不固、肾阴亏虚为主；针对肾病综合征采用肾上腺 皮质激素及细胞毒药物的用药规律，确立肾虚证候的变化规律：在大剂量阶段，为肾阴虚 火旺，撤减阶段向肾气虚、肾精虚、肾阳虚、肾阴阳两虚转变，维持阶段，以肾阳虚为主； 从而确立了滋肾降火、益气养阴、补肾填精、阴阳双补、温肾助阳等法对激素的减毒增效 作用。整理应用经方、古方 32 首，审定的协定处方 18 个、院内制剂 15 种，在缓解临床症 状、降低西药免疫抑制剂的毒副作用、改善生活质量、延缓疾病的进展等方面发挥着重要 作用，疗效达到国内领先水平 。2002 年我科被国家中医药管理局确定为重点学科建设单 位，也是我省目前唯一的国家局中医药重点学科；2007 又被国家中医药管理局确定为重点 专科建设单位。 注重肾藏象基础理论的研究以指导临床，我科通过对先秦至明清 124 部古代医籍的整 理，建立古代文献数据库并在网上运行（） ；通过对 1980 年以来现代文献 的整理，建立现代文献数据库并在网上运行（） ；并对 106 个重要的名词 术语概念进行了诠释规范。整理 33 位近代医家治疗慢性肾衰竭、肾病综合征、慢性肾小球 肾炎的经验，出版当代中医肾脏病临床经验精粹 。通过文献研究，提炼出“外邪犯肾” 的学术观点，补充了肾病病机理论，对于早期慢性肾脏病从肾防治具有重要指导意义；提 出“补肾生髓成肝”的假说并加以研究，发展了肝肾同源理论和肾藏精理论，对临床采用 滋补肝肾防治慢性肾脏病及慢性肝病具有重要指导意义；开展肾病冬治、冬病夏治取得成 效，丰富了肾病治疗学内容。于 2005 年主编出版第一部专科理论专著中医肾病学基础 ， 为慢性肾脏病的可持续研究奠定了良好的理论基础。 针对“肾虚证”临床基础好的院内制剂、经方、古方开展基础及开发应用研究。采用 中药“枯痔灵”复制慢性肾脏纤维化动物模型，为国内首创，于 1998 年获国家中医药管理 局基础研究二等奖。 “肾康冲剂对慢性肾衰竭的临床与实验研究” ，证实滋肾养阴为主延缓 慢性肾脏疾病进展，于 1998 年获湖北省政府科技进步三等奖。 “大黄素、川芎嗪对中分子 物质所致大脑皮层神经元损伤的保护作用研究” ，证实大黄、川芎的有效部位群对尿毒症脑 病的作用机理，于 2000 年获湖北省政府科技进步二等奖。 “肾安颗粒治疗慢性肾衰竭的研 究” ，从临床和病理组织学证实温补肾阳对慢性肾脏疾病的治疗作用，于 2003 年获湖北省 政府科技进步二等奖。 “肾安颗粒阻缓肾硬化的作用机理” ，2004 年获湖北省重大科技成果。 “排石冲剂治疗肾结石”的研究，证实行气活血、清热利湿、兼滋肾养阴对尿路结石的效 果，于 2006 年获湖北省政府科技进步二等奖。2003 年完成“肾康胶囊治疗慢性肾炎肾阴 虚证” 的多中心临床试验，2004 年完成“保肾片治疗慢性肾衰竭气阴两虚证”的多中心 临床试验，研究结果显示：滋肾养阴、益气养阴治疗能够缓解症状，减轻蛋白尿、血尿， 在一定程度上延缓肾脏疾病的进展。2005 年参与完成 973 项目中“慢性肾衰竭证候要素的 临床流行病学横断面调查” ，证实“肾虚”是辩证的重要环节。 目前与“肾虚证”有关的在研项目中， “肾安颗粒的开发研究” 、 “肾康冲剂的研究” 分别获得国家中医药管理局新药基金、湖北省科技厅、武汉市科技局攻关项目的资助，按 新药标准进行研究。 “补肾生髓成肝关键蛋白质的相互作用机制” ，获国家自然科学基 金重点项目资助，对左归丸促进小鼠骨髓形成肝细胞的关键蛋白质进行研究，是肝肾同源 理论的源头创新。 “慢性乙型肝炎肝肾阴虚证的生物学基础研究” ，获国家自然科学基金项 目资助，运用肾藏象理论促进学科交叉研究。 “肾气不固的分子基础及肾气丸的干预作用” 、 “六味地黄丸对肾病综合征大鼠模型足细胞的影响” 、 “左、右归丸对肾阳虚证大鼠模型相 关成体干细胞的影响”等研究，有望揭示肾虚证的生物学基础，及肾气丸、左、右归丸、 六味地黄丸等千古名方的作用机理，进一步充实发展肾藏象学理论。 逐渐完善形成中医诊疗规范，1998 年出版中医病证诊疗常规 ；2003 年制定慢性肾 衰竭、肾病综合征、慢性肾小球肾炎中医诊疗草案应用于全科；2005 年加以修订应用于全 院，作为国家中管局中医药重点学科中期验收的内容通过验收，并成为国家中管局“内科 疾病中医、中西医结合治疗指南”的一部分；2006 年作为主要单位参与中华中医药学会肾 病分会制定慢性肾衰竭、肾病综合征、慢性肾小球肾炎辨证分型及疗效评定标准草案并公 开发表； 2007 年参与国家科技部十一五科技支撑计划“慢性肾脏病中医临床证治优化方 案的示范研究” ；2007 年制定慢性肾脏病肾虚证的辨证细则及诊疗规范，作为中医药重点 学科终期验收的内容通过验收。于 2008 年初主编出版常见病中西医最新诊疗进展丛书原 发性慢性肾小球肾炎 、 慢性肾衰竭两部专病专著。 本研究拟整合以往研究的成果，采用实验研究和临床流行病学/DME 相结合的方法， 通过对“肾虚证”大鼠模型的研究，探讨肾虚证的实质，及滋补肾阴、温补肾阳、阴阳双 补对相关成体干细胞的影响。通过多中心临床试验进一步验证补肾制剂的临床疗效，完善 慢性肾脏病“肾虚证”的诊疗规范，采用代谢组学方法，建立病-证-方-药的量效联系，最 终编制“中医药治疗慢性肾脏病肾虚证的临床实践指南” ，并带动相关新药和诊疗技术的研 发，创造更好的社会效益，并给社会带来经济效益。 参考文献：参考文献： 1 K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation， classification， and stratification. Kidney Disease Outcome Quality Initiative J. Am J Kidney Dis， 2002， 39（2 suppl 2）: S1-246 2 王海燕 慢性肾脏疾病防治的新概念，现代实用医学 2004，16（12）：691-693 （二）（二） 、立项依据、立项依据 现代医学研究发现，成体组织器官功能是由干细胞来维持的1，代谢组是从代谢网络 终端表象的综合状态反映生物体的功能状态的。成体干细胞是指存在于一种已分化组织中 的未分化细胞，主要包括骨髓和外周血干细胞以及多种驻留于不同组织器官的内源性干细 胞2。成体干细胞具有自我更新和多能分化潜能的特性3。自我更新指在分裂增殖过程中， 子代细胞仍然保持干细胞的属性。多向分化的潜能使来自组织器官的干细胞，能够分化形 成相应的功能细胞，构筑相应的组织器官。在整个生命过程中，成体干细胞在维持组织器 官的结构和功能的长期稳定方面发挥着极其重要的作用4，5 。慢性肾脏病呈不可逆进展， 必定存在肾脏干细胞、骨髓造血干细胞等相关成体干细胞的更新、分化的障碍，中医认为 是“肾中精气不足，阴阳亏损”所致。 代谢组学是一门“在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机 体生命活动代谢本质”的科学6，是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生 物系统的组学方法。代谢组学利用高通量、高灵敏度与高精确度的现代仪器分析技术，对 机体整个代谢产物谱进行动态跟踪分析，发现与疾病相关的一组特征性生物标志物，辅助 临床诊断。常用技术有核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）和质谱联用7。如 用 NMR 检测关节腔内的滑膜液，有助于骨关节炎、类风湿性关节炎及创伤性关节炎的鉴 别8。从系统生物学的角度认识生命本质来看，疾病是因蛋白质网络和基因调节网络被 “扰动”所致，而中医的“证候”可能是蛋白质网络和基因调节网络被“扰动”后所发生 的一种特异性偏离状态。这一被扰动的网络可通过其分泌到血液、尿液等体液或其它组织 的内源性成分的改变而客观地反映出来，用代谢组学技术可以捕捉到这些细微的变化，获 得偏离出正常范围的特征性代谢表达图谱。也就是说，这些特征性代谢表达图谱正是中医 证候规律的物质基础以“组” 、 “群” 、 “谱”集成形式的反映。 如果说成体干细胞是基因蛋白新陈代谢产物这样一个生命活动链的发生、发展， 是疾病状态下中医“证”的物质基础；那么代谢组就是这条链的终点集合体，反应的是疾 病对生命体作用所产生效应的最终结果，是中医“证侯”的微观表现。就慢性肾脏病而言， 肾脏干细胞、骨髓造血干细胞等相关成体干细胞的更新分化障碍是肾虚证的物质基础，代 谢组则反应着肾阴（精）虚证、肾阳（气）虚证、阴阳两虚证等各自的微观证侯待征，补 肾（补阴、温阳、阴阳双补）中药则通过调节肾脏干细胞的活性、数量，从而纠正代谢组 的特异性“偏离状态” 。 氢化可的松肾阳虚模型自上世纪 60 年代创立以来9，至今仍被作为肾虚证的经典模型 广泛使用。已有代谢组学研究已经显示，氢化可的松肾阳虚证动物体内的酪氨酸、酪胺、 多巴胺、去甲肾上腺素等交感神经及肾上腺皮质相关的代谢物与正常对照相比，差异均有 显著性10。因此，进一步探讨该模相关成体干细胞的活性、数量，有望揭示肾虚证的实质。 造血干细胞是目前研究最为成熟的成体干细胞，拥有相对特异的表面标志 Sca+、CD34+等； 近年来的研究发现肾皮质内存在表面标志为 CD133+的肾脏干细胞11，12。对有一定表面标 志的细胞，比较有效的分离手段是免疫磁珠、流式细胞仪13。因此，这一研究方案具有可 操作性。 NMR 是目前代谢组学研究最常用的工具，主要有氢普（1H NMR） 、碳普（13C NMR） 及磷普（31P NMR）三种，1H NMR 尤为常用。NMR 具备快速、动态、非偏向、非破坏、 多参数检测以及无需样品前处理等优点。通过临床研究，对慢性肾脏病（慢性肾炎、原发 性肾病综合征、慢性肾小球肾炎）患者依据中医理论进行肾虚证侯分型肾阴（精）虚、 肾阳（气）虚、阴阳两虚 ，留取血、尿标本，应用 NMR 技术确定慢性肾脏病各肾虚证侯 型代谢物普特点，从而为慢性肾脏病肾虚证辨证提供量化依据。 明代医家张景岳提出“善补阳者，必于阴中求阳” 、 “善补阴者，必于阳中求阴” ，并 创立了补肾千古名方：左归丸、右归丸，它们对肾阴虚、肾阳虚证的疗效已被长期临床实 践所证实。本研究采用滋补肾阴的左归丸、院内制剂肾康冲剂，温补肾阳的右归丸、院内 制剂肾安颗粒，左右归各半丸进行干预，观察其对患者代谢物普的影响及对肾虚证模型相 关成体干细胞的作用，阐明张景岳“阴中求阳” 、 “阳中求阴”这一补肾法则的内涵，指 导临床合理配伍温阳药、补阴药治疗肾虚证。 因此，我们认为从相关成体干细胞的角度研究慢性肾脏病“肾虚证” ，可在一定程度上 阐明“肾虚证”的微观本质；而代谢组学方法，能在整体上把握“肾虚证”的动态变化， 并对干预措施的效果进行定量分析，成为确定病-证-方-药量效联系的依据，为相关新药和 诊疗技术的研发提供新的途径，发展中医肾藏象理论内涵。 参考文献：参考文献： 1 Reya T， Clevers HWnt signaling instem cells and cancerNature，2005，434（7035）：843-850 2 聂君，李劲松，龚勇泉成体干细胞与肺损伤修复国际呼吸杂志，2007，27（18）： 1385-1389 3 Lowry WE， Richter LSignaling in adult stem cellsFront Biosci，2007，12：3911-3927 4 Kenyon J， Gerson SLThe role of DNA damage repair in aging of adult stem cellsNucleic Acids Res，2007，35（22）：7557-7565 5 Reya T， Clevers HWnt signaling in stem cells and cancerNature，2005，434（7035）：843-850 6 Lindon JC，Holmes E，Nicholson JKSo whats the deal with metabonomics？ Anal Chem2003；75（17）：384A-391A 7 Dunn WB，Bailey NJ，Johnson HEMeasuring themetabolome：current analytical technologiesAnalyst2005；130（5）：606-625 8 陈慧梅，刘志红代谢组学及其研究方法和应用肾脏病与透析肾移植杂志， 2005，14（1）：59-64 9 邝广堃，吴裕，丁霆，等某些助阳药对于大剂量皮质激素所致耗竭现象的影响中 华内科杂志，1963，2（2）：113 10 Chen MJ，Zhao LP，Jia W，et alMetabonomic study on the biochemical profiles of a hydrocortisone induced anmialmodelJproteomeRes，005，4（6）： 2391-2396 11 Bussolati B，Bruno S，Grange C，et alIsolation of renal progenitor cells from adult human kidneyAm J Pathol，2005，166（2）：545-555 12 Sagrinati C，Netti GS，Mazzinghi B，et alIsolation and characterization of multipotent progenitor cells from the Bowmans capsule of adult human kidneysJ Am Soc Nephrol，2006，17（9）：2443-2456 13 谌卫，姚真真，冯伟华，等成体干细胞的可塑性生命的化学， 2004，24（4）：296-298 二、主要研究内容二、主要研究内容 （一）研究内容（一）研究内容 1、肾阳虚证大鼠肾脏干细胞、骨髓造血干细胞数量、活性的研究。 2、滋补肾阴、温补肾阳、阴阳双补对肾阳虚证大鼠肾脏干细胞、骨髓造血干细胞数量、 活性的影响。 3、慢性肾脏病肾阴（精）虚、肾阳（气）虚、阴阳两虚证患者血、尿代谢组学研究。 4、滋补肾阴、温补肾阳、阴阳双补对慢性肾脏病肾阴（精）虚、肾阳（气）虚、阴阳 两虚证患者血、尿代谢组的影响 （二）研究目标（二）研究目标 1、证实“肾虚证”与肾脏干细胞、骨髓造血干细胞等相关成体干细胞的更新、分化障 碍有关 2、证实左归丸、肾康冲剂、右归丸、肾安颗粒、左右归各半丸通过补肾阴、温肾阳、 阴阳双补对相关成体干细胞产生作用和影响，从而达到逆转肾病变的治疗效果。 3、证实慢性肾脏病肾阴（精）虚、肾阳（气）虚、阴阳两虚证存在相应特征性代谢物 普的变化。 4、证实左归丸、肾康冲剂、右归丸、肾安颗粒、左右归各半丸能改善慢性肾脏病肾阳 虚、肾阴虚、阴阳两虚证患者血、尿代谢组，从而确定方证的量效关系。 （三）拟解决的关键科学问题（三）拟解决的关键科学问题 从肾脏干细胞、骨髓造血干细胞数量、活性的变化，探讨肾虚证的物质基础；运用代 谢组学技术，整体上把握“肾虚证”的动态变化，并对干预措施的效果进行定量分析，确 定病-证-方-药量效关系，在一定程度上阐明温补肾阳、滋补肾阴、阴阳双补的作用机制， 发展张景岳提出的“善补阳者，必于阴中求阳” 、 “善补阴者，必于阳中求阴”之补肾法 则，充实发展中医肾藏象理论。 （四）拟采取的研究方案（四）拟采取的研究方案 研究方案研究方案 第一部分为动物实验研究，以氢化可的松肾阳虚大鼠为研究对象，观察肾阳虚证肾脏 干细胞、骨髓造血干细胞数量、活性的变化及滋补肾阴、温补肾阳、阴阳双补的干预作用。 第二部分为多中心临床试验研究，主要观察慢性肾脏病肾虚证肾阴（精）虚、肾阳（气） 虚、阴阳两虚血清、尿液代谢物普（1H NMR 普）特征及滋补肾阴、温补肾阳、阴阳双补 的干预作用。 总总技技术术路路线线 图图： 氢化可的松 肾阳虚大鼠 慢性肾脏病 肾虚证患者 滋补肾阴 温补肾阳 阴阳双补 肾脏干细胞、骨 髓造血干细胞活 性 肾脏干细胞、骨 髓造血干细胞数 量 补肾药的干预 作用 血、尿 1H NMR 代谢物普抽样 活性 肾虚证之物质 基础 肾虚证侯代谢 组学特征 肾虚证代谢组学 定量特征 肾虚证方证 量效关系 肾虚证实质与相关成体 干细胞相关 慢性肾脏病肾虚证 动物实验临床试验 第一部分第一部分 实验研究实验研究 1 实验动物的分组、肾阳虚大鼠模型的复制及给药实验动物的分组、肾阳虚大鼠模型的复制及给药 （1）动物及分组：SD大鼠，随机分为正常对照组、肾阳虚模型组、左归丸组、肾康 组、右归丸组、肾安组、左右归各半丸组。 （2）药物：肾康冲剂、肾安颗粒为湖北省中医院制剂；右归丸、左归丸购自北京同仁 堂股份有限公司同仁堂制药厂。 （3）肾阳虚大鼠模型的复制及给药： 正常对照组：肌肉注射生理盐水2ml/（只d） ，连续12d天，之后灌服蒸馏水 2ml/（只d）连续15d。 肾阳虚模型组：模型的复制参照有关资料（陈小野实用中医证候动物模型 M北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993， 104-108 ） 。 肌肉注射氢化可的松10mg/（只d） ，连续12d，之后灌服蒸馏水2ml/（只d）连续 15d。 左归丸组：前12d同肾阳虚模型组，之后左归丸混悬液2ml/（只d）灌服，连续 60d。 肾康组：前12d同肾阳虚模型组，之后肾康冲剂混悬液2ml/（只d）灌服，连续 60d。 右归丸组：前12d同肾阳虚模型组，之后右归丸混悬液2ml/（只d）灌服，连续 60d。 肾安组：前12d同肾阳虚模型组，之后肾安颗粒混悬液2ml/（只d）灌服，连续 60d。 左右归各半丸组：前12天同肾阳虚模型组，之后左归丸加右归丸（11）混悬液 2ml/（只d）灌服，连续60d。 2 肾脏干细胞、骨髓造血干细胞数量的研究肾脏干细胞、骨髓造血干细胞数量的研究 （1）检测肾脏干细胞数量： 新药、新诊疗技术研发 编制慢性肾脏病肾虚证临床实践指南 手术摘除肾脏，除去筋膜，眼科剪剪切成小组织块，含IV胶原酶的RPMIl640培养液 消化。 离心除去IV胶原酶，细胞加入适量PBS，吹匀后过400目滤网，收集单细胞悬液。 淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，重悬细胞并计数，加入Fc受体阻滞剂和 SSC/CD133PE，以SSC/CD133PE双参数设门，流式细胞仪检测细胞中CD133阳性细胞 的表达率。 （2）检测骨髓造血干细胞数量： 无菌条件下分离出小鼠的股骨， 用针头在股骨干骺端钻孔，吸取10mLIMDM培养 液，从股骨一端冲洗骨髓腔，将骨髓细胞吹到培养皿内，用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液， 50目铜网过滤， 收集过滤的细胞悬液，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心去上清液后 重新制备细胞悬液，细胞接种于含10%胎牛血清和10%马血清的IMDM培养基中培养48h后 收集非贴壁的悬浮细胞。 细胞计数，吸取100ul细胞悬液（细胞浓度1106个/ml） ，分别加入PE 标记的大 鼠抗小鼠Sca-1抗体和FITC标记的大鼠抗小鼠CD34抗体，溶红细胞处理仪机洗后，重新悬 浮，上流式细胞仪检测Sca+CD34+细胞百分比。 3 肾脏干细胞、骨髓造血干细胞活性的变化肾脏干细胞、骨髓造血干细胞活性的变化 （1）检测肾脏干细胞活性： 肾脏单个核细胞分离步骤与第二部分相同。 免疫磁珠法分选肾脏干细胞：重悬细胞并计数，分别加入 Fe 受体阻断剂和 CD133 微磁珠标记细胞，混匀后在 4-8冰箱内孵育 30min，MS 柱 2 次分选阳性细胞。 检测细胞活性：a.采用流式细胞仪检测 S 期细胞比例，测定细胞增殖能力；b.苔盼兰 染色检测细胞活性。 （2）检测骨髓造血干细胞活性： 骨髓单个核细胞分离方法见第二部分。 免疫磁珠法分选骨髓造血干细胞：收集悬浮的细胞，细胞计数，加 Sca-1 MultiSort 磁珠 4冰箱内孵育标记 Sca-1+细胞，MS 柱分选阳性细胞。 检测细胞活性：检测方法同上。 实验研究技术路线图：实验研究技术路线图： 正常对照组模型组 手术摘取器官组织 肾 脏股 骨 分离组织，制 备单细胞悬液 肾脏单个 核细胞 骨髓单个 核细胞 离心分离离心分离 CD133 阳 性细胞表 达率（流 式细胞仪） 免疫磁珠 法分选 CD133 阳 性细胞 检测 Sca + CD34 + 细胞百分 比（流式 细胞仪） 免疫磁珠 法分选骨 髓造血干 细胞 左归丸组 SD 大鼠 右归丸组左右归各半丸组肾康冲剂组肾安颗粒组 第二部分第二部分 临床研究临床研究 1 慢性肾脏病诊断标准（依据慢性肾脏病诊断标准（依据 K/DOQI 临床指南制定的标准）临床指南制定的标准） （1）肾脏损伤（肾脏结构或功能异常）3 个月，可以有或无 GFR 下降，可表现为 下面任何一条： 病理学检查异常； 肾损伤的指标：血、尿成分异常或肾脏影像学检查异常； GFR60ml/min/1.73m23 个月，有或无肾脏损伤证据。 （2）符合慢性肾小球肾炎、原发性肾病综合征、慢性肾小球肾炎三种疾病的西医诊断 标准。 （3）慢性肾脏病分期标准（根据 K/DOQI 临床指南） 见表 1 表 1 慢性肾脏病分期标准（1-4 期） 阶段描述GFR （ml/min/1.73m2） 1肾损伤 GFR 正常或增加 90 2肾损伤 GFR 轻度下降6089 3GFR 中度下降3059 4GFR 重度下降1529 2 肾虚证候诊断标准肾虚证候诊断标准 （1）肾阴（精）虚证 主症：口咽干燥 腰膝酸痛 五心烦热口唇爪甲淡白健忘 次症：目睛干涩 头晕耳鸣 虚烦少寐 心悸 遗精、早泄或月经量少 不孕、 不育 大便干燥 流式细胞仪检测细胞 增殖能力，苔盼兰染 色检测细胞活性 汇总数据，分析肾阳虚汇总数据，分析肾阳虚 大鼠肾脏干细胞、骨髓大鼠肾脏干细胞、骨髓 造血干细胞数量、活性造血干细胞数量、活性 的变化以及肾康、左归的变化以及肾康、左归 丸、肾安、右归丸、左丸、肾安、右归丸、左 右归各半丸的干预作用右归各半丸的干预作用 肾肾虚虚物物质质基基 础础与与相相关关成成 体体干干细细胞胞的的 更更新新、分分化化 障障碍碍有有关关 温阳、补阴、阴温阳、补阴、阴 阳双补影响相关阳双补影响相关 成体干细胞，达成体干细胞，达 到逆转肾病变效到逆转肾病变效 果果 舌脉象：舌红少苔，脉细数或沉细 （2）肾阳（气）虚证 主症：畏寒肢冷 腰膝酸软或冷痛 夜尿增多 少气乏力 易感冒 次症：面色咣白 经久泄泻 面浮肢肿 性功能减退或阳痿 舌脉象：舌淡胖或有齿痕，苔白滑；脉沉弱或细 以上各证，具备主症三项；或主症两项，次症两项即可诊断。 （3）肾阴阳两虚证 分别具备肾阳虚证及肾阴虚证主症两项；或主症一项，次症两项即可诊断。 3 病例入选病例入选 （1）病例纳入标准 符合慢性肾脏病诊断标准、符合慢性肾小球肾炎、原发性肾病综合征、慢性肾小球 肾炎西医诊断标准、符合肾虚证诊断标准。 年龄18 岁，65 岁。 （2）病例排除标准 妊娠或哺乳期妇女。 合并有心、脑、肝和造血系统等严重原发性疾病，过敏体质。 无法合作者，如精神病患者。 4 试验例数与分组方法试验例数与分组方法 （1）以湖北省中医院为研究中心，以重点学科 5 个协作单位（黑龙江省中医药研究 院、长春中医学院附属医院、成都中医药大学附属医院、深圳市中医院、柳州市中医院） 为分中心，总例数不少于 700 例。 （2）分组方法：将入选患者随机分为肾康组、左归丸组肾阴（精）虚证、肾安组、 右归丸组肾阳（气）虚证、 左右归各半丸组（肾阴阳两虚证） ；对照组又分专家辩证组 和西药对照组；每组 100 例。另选 50 例成人健康志愿者作为正常组，留取血、尿标本，进 行代谢组学分析. 5 观察指标观察指标 （1）中医症状、体征、舌象、脉象。 （2）实验室检查指标：血常规、尿常规、肌酐清除率、肝功能、24 小时尿蛋白定量、 双肾 B 超、心电图。 （3）不良反应 6 代谢组学抽样分析（在武汉大学进行）代谢组学抽样分析（在武汉大学进行） 利用基于核磁共振氢谱的代谢组学分析方法分别检测血清、尿液的组成变化。 （1）清晨采血（采血前 8h 禁食） ，室温下自然凝固 1h，收集血清；同时留取尿标本。 血清及尿标本20冰箱中保存备用。 （2）NMR 测量前样品准备 取出标本，常温解冻，4 10000r/min，离心 10 min，取上层液 300l 加至 5mm 的 NMR 试管中，添加 0.1% 2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）重水（D2O）溶液 100l、200l D2O，振荡混匀，置 4冰箱，保存备用。 （3）1H NMR 普的记录 在 AVANCE 600 超导傅里叶变换 NMR 仪上调用 noesypr1d 脉冲序列，采用预饱和方 式抑制水峰，预饱和时间为 2s，谱宽 9615Hz，采样点数 64k，采样时间 3.41s，累加次数 128 次，并控制温度在 298.2K。FID 信号经过 32K 傅里叶变换转为 1H NMR 谱图。 （4）1H NMR 谱的分段积分与数据预处理 以 TSP 为化学位移参考峰的位置，设为 0。相位和基线调整后将氢谱的 0.29.8 区域进行分段积分，每段为 0.04 为了避开溶剂峰压制对谱图造成的影响，水峰附近的区域 （4.25.2）被去除。将积分数据归一化之后，以文本文件或 Excel 文件贮存，用于模式 识别分析。 （5）NMR 数据的模式识别分析 将积分值进行中心化和比例换算，用 SIMCA-P 10.5 软件包，进行主成分分析 （principal componentanalysis，PCA） ，求出主成分（principal components，PC） ，利用 PC 对各组样本血清、尿液的代谢组进行分析。 7 治疗方法治疗方法 （1）治疗组 肾阴虚证、肾阳虚证、阴阳两虚证分别采用左归丸、肾康冲剂、右归丸、 肾安颗粒、左右归各半丸。 （2）对照组 专家辩证组采用中医专家（副主任医师或副教授以上的两人）辨证或辨 病用药；西药治疗组采用西药治疗。 （3）各组依据病情，可采用免疫抑制剂及西药对症治疗。 （4）观察时间：60 天 8 疗效判定疗效判定 （1）证候疗效标准（参照中药新药临床研究指导原则） 临床痊愈 中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少95%。 显效 中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少70%。 有效 中医临床症状、体征均有好转，证候积分减少30% 无效 中医临床症状、体征无明显改善，甚或加重，证候积分减少不足 30%。 注：计算公式（尼莫地平法）为：（治疗前积分-治疗后积分）治疗前积分 100%。 （2）实验室指标疗效标准 以慢性肾小球肾炎、原发性肾病综合征、慢性肾小球肾炎三种疾病的西医疗效标准 为主体。 生存质量评定标准 代谢组学量化标准 9 数据分析处理数据分析处理 （1）建立肾虚证辨证标准。 （2）建立肾虚证诊断血、尿代谢组普。 （3）建立肾虚方证联系。 临床试验技术路线图：临床试验技术路线图： 符合慢性肾脏病诊断标准 对照组 符合肾虚证诊断标准 专家辨证组 治疗组 西药对照组右归组 左右归各半丸组 组 左归组左右各半组 血、尿 1H NMR 普 主 成 分 分 析 疗 效 判 定 正常组 多中心临床试验 肾康组肾安组 右归组 肾安组 （五）可行性分析（五）可行性分析 1、本课题立论依据有其理论渊源和临床基础，实验设计合理，技术路线明确。 2、本课题所需仪器设备大部分可在湖北中医学院相关实验室获得，代谢组学分析在武 汉大学（协作单位）进行，所需试剂已商品化，采用的均为成熟可行的实验技术，课题组 成员已熟悉掌握所需技术。 3、课题组成员构成合理，由科研经验丰富的教授、博士生导师、博硕士研究生组成， 确保课题能保质保量按时完成，达到预期成果。 4、课题承担单位拥有国家中医药管理局批准的三级科研实验室-分子生物实验室，中 药临床药理实验室（中管局二级） ，SPF 级动物实验室，湖北省中医院临床评价中心、国家 中药新药临床试验机构，作为主要的学术研究基地。 5、根据病种建设的研究方向，实验基地已建立起完整的专业检测室，包括生化免疫 室、细胞培养室、基因检测室、图像分析室等，保证本课题的实施。 （六）风险分析（六）风险分析 1.1. 肾虚证的代谢组学研究风险肾虚证的代谢组学研究风险 新兴学科代谢组学的研究方法为中医药复杂理论体系的研究、中医药现代化提供了强 有力的研究手段。本研究首次应用代谢组学对慢性肾脏病“肾虚证”引起代谢物组进行共 性分析，整体评价补肾中药复方的疗效，其信息含量具有相当的广泛性和复杂性，属于探 肾虚证方证量效关系肾虚证方证量效关系 肾康组 左归组 左右各半组 代谢物普抽样代谢物普抽样 形成诊疗方案、标准形成诊疗方案、标准形成新药、新诊疗技形成新药、新诊疗技 术术 编制编制慢性肾脏病肾虚证临床实践指南慢性肾脏病肾虚证临床实践指南 索性研究，有可能达不到预期的结果，或需要增加抽样病例数量，而增加费用。本研究将 借助于武汉大学国家重点实验室及核磁共振波谱学基地在代谢组学研究方面的技术和人才 优势，在多学科交叉方面下工夫，加强信息和数据的关联分析，以提高研究结果的应用价 值。 2 2多中心临床试验的风险多中心临床试验的风险 2.1 在多中心临床试验中，其质量控制的好坏是试验成败的关键，也是课题面临的最 大风险。本研究拟建立一套严密的课题管理和监控机制，尽量保证实验数据的真实可靠， 并为今后“脾虚证” 、 “肺虚证”等证候诊疗方案研究提供示范。 2.2 因多临床试验的周期较长，诊疗方案有个体差异性。如果患者依从性较差，可能 会导致脱落，剔除病例增多，病例数增大，导致费用增加；还有可能部分临床试验出现阴 性结果。 2.3 在临床用药方面，方案涉及的中成药及西药参考目录，优选正规厂家生产的 GMP 认证药品及道地药材统一配送，并定期监察各医院执行情况。最大程度降低药品本身对试 验的影响。 2.4 由于本研究难以对不同的治疗方案进行随机分组，对治疗方案的有效性评价，可 能存在分组偏倚，本研究将有专业的统计学人员对研究的方案设计，实施及分析进行全程 参与，采用多元统计方法进行分析，在调整相关危险因素影响后对研究干预效应作出科学 评价。 2.5 数据管理是临床研究过程中极为重要的一环，直接影响到统计分析结论及实验结 果的客观性、准确性和完整性。因此，在临床研究的设计阶段就建立规范的临床数据管理 步骤和程序，为后期的统计及其他工作打下良好的基础。 （七）本项目的特色与创新之处（七）本项目的特色与创新之处 1、从肾脏干细胞、骨髓造血干细胞的角度探讨慢性肾病“肾虚证”的物质基础。 2、应用代谢组学方法探讨慢性肾