毕业论文：富硒植物中硒的形态分析研究.pdf

成都理工大学 硕士学位论文 富硒植物中硒的形态分析研究 姓名：管凌飞 申请学位级别：硕士 专业：分析化学 指导教师：范必威 20070401 摘要 富硒植物中硒的形态分析研究 作者简介：管凌飞，男，1 9 7 1 年0 9 b 出生，2 0 0 4 年0 9 月师从于成都理工大学范必 威教授，于2 0 0 7 年0 6 月获硕士学位。 摘要 硒是人体必须的微量元素之一，对人体的健康具有重要意义。本文主要是针 对富硒生物样品中硒的各种形态进行定量分析，以期全面了解富硒植物中硒的形 态分布规律，为富硒产品的生产、开发和利用提供有益的参考。 在文献工作的基础上，对植物中硒的形态分析流程和样品的预处理方法进行 了改进和优化：采用了d 1 0 1 大孔吸附树脂替换x a d 2 树脂来消除可溶有机质对 测定的干扰：确定了水提取植物中无机硒的具体操作条件和流程；采用了先微波 密闭消解后又湿法消解处理样品使加标回收率明显提高( 达9 7 ) ；选择了酸式还 原法将s e ( v i ) 还原为s e ( i v ) 。 本文的研究结果表明：富硒环境下的大蒜、螺旋藻与同类的普通大蒜和螺旋 藻相比，除在有机硒和不溶态硒占总硒的百分率较高外，在无机硒、s e ( i v ) 、s e f v d 以及可溶态硒、可溶态有机硒均较低；硒主要是以有机硒的形式存在，占总量的 9 3 以上；无机硒又主要以s e ( i v ) 的形式存在，s e ( v i ) 的含量不到总硒的o 6 ； 样品植物体内的可溶态硒约占总硒的7 0 左右，其中可溶态有机硒占总硒的 6 0 6 5 ，可溶态有机硒占可溶态硒的9 0 以上；富硒植物在富硒土壤或外加 硒培养的环境下，在硒的富集和转化中，外界的无机硒基本上是转化为有机硒， 对植物中的无机硒特别是s e ( v i ) 的累积效应不明显，即s e ( v i ) 的含量随外加硒的 富集无明显增高的趋势；不同类富硒植物对硒的富集程度也存在着差异，符合植 物由于品种和生长环境等不同的实际情况引起的的自然规律。 关键词：植物 硒 形态分析 成都理一i ：人学硕十学位论文 a n a l y z e a n dr e s e a r c hs p e c i a t i o no fs e l e n i u mi n s e l e n i u m r i c hp l a n t s a b s t r a c t s e l e n i l u ni so n eo ft h ee s s e n t i a lm i c r o e l e m e n t so ft h eh u m a nb o d y ：i ti so fg r e a t i m p o r t a n c et oh e a l t h t h i st h e s i si sm a i n l ya b o u tt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fs e l e n i u m o fd i f f e r e n ts p e c i a t i o n si ns e l e n i u m - r i c hp l a n ts a m p l e s ，f o rt h ep u r p o s eo ff u l l y u n d e r s t a n d i n gt h ed i s t r i b u t i o nr e g u l a t i o no fs e l e n i u mi ns e l e n i u m r i c hp l a n tp r o d u c t s t op r o v i d er e f e r e n c ef o rt h ep r o d u c t i o n , d e v e l o p m e n ta n du s a g eo fs e l e n i u m r i c h p r o d u c t s w em a d eu s eo fa n di m p r o v e dt h ef l o wp a t ho fs p e c i a t i o n - a n a l y s i so fs ei np l a n t s a n dt h ep r e t r a n s a c tm e t h o do fs a m p l e sa c c o r d i n gt or e f e r e n c e s ；u s e dd 1 0 1b i g - b o r e a b s o r br e s i ni n s t e a do fx a d 2r e s i nt oe l i m i n a t et h ei n t e r f e r e n c eo fd i s s o l v e do r g a n i c ； a s c e r t a i n e dt h ec o n c r e t eo p e r a t i n gc o n d i t i o na n df l o wp a t ho fw a t e r - e x t r a c t i o no f i n o r g a n i cs ei np l a n t s ；a d o p t e df w s tm i c r o w a v e - a s s i s t e dd i g e s t i o nt h e nw e t - d i g e s t i o n m e t h o dt ot r a n s a c ts a m p l e s ，c o n s p i c u o u s l yi m p r o v e dt h er e c o v e r yo f t h em e t h o d ( u pt o 9 7 ) ；c h o s ea c i d - d e o x i d i z a t i o nb a s e do nc o m p a r a t i v ee x p e r i m e n t st od e o x i d i z es e ( v d t os e ( i v ) t h er e s u l to fr e s e a r c hs h o w e dt h a t ：t h ec o n t e n tp e r c e n t a g eo fi n o r g a n i cs e 、 s e ( ) 、s e ( v i ) a n dd i s s o l v e ds ea n dd i s s o l v e do r g a n i cs eo fg a r l i c sa n ds p i m l i n a t a b l e t s g r o w ni ns e l e n i u m - r i c he n v i r o n m e n ti ss m a l l e r ( e x c e p to r g a n i cs ea n d u n d i s s o l v e ds eb i g g e r ) c o m p a r e dw i t ht h es 咖ek i n dc m n _ q l o ng a r l i ca n ds p i r n l i n a t a b l e t s s em a i n l ye x i s t si no r g a n i cs p e c i a t i o n ，m a k i n gu p9 3 o rm o r eo ft h et o t a l a m o u n t a m o n gt h ei n o r g a n i cs p e c i a t i o ni tm a i n l ye x i s t sa ss e ( i v ) ，t h ec o n t e n to fs e ( v i ) i ss m a l l e rt h a no 6 o f t h et o t a la m o u n t ；t h ea m o u n to f d i s s o l v e ds ei nt h es a m p l e si s a b o u t7 0 o ft h et o t a la m o u n to fs e , t h ea m o u n to fd i s s o l v e do r g a n i cs em a k e su p a b o u t6 0 6 5 o f t h et o t a la m o u n to f s e ，a n dm a k i n gu p9 0 o rm o r eo f t h et o t a l d i s s o l v e ds e ；i nt e r m so ft h ee n r i c ha n di n v e r to fs eo ft h es e l e n i u m - r i c hp l a n t sw h i c h a r eg r o w ni ns e l e n i u m - r i c hs o i lo ru n d e ra d d i t i o n a ls e l e n i u mc u l t u r e ，t h es ef r o mt h e e n v i r o n m e n ti sm a i n l yi n v e r t e dt oo r g a n i cs e t h ea c c u m u l a t i o no fi n o r g a n i cs e ， e s p e c i a l l ys e ( v i ) ，i sn o tc o n s p i c u o u s c o n c l u s i v e l y , t h ec o n t e n to fs e i ) h a sn o o b v i o u st e n d e n c yo fi n c r e a s ew i t l lt h ee n r i c h m e n to fs ei nt h ee n v k o n m e m a n d d i f f e r e n tk i n do fp l a n t sa b i l i t yt oe n r i c hs ea l s od i f f e r s i tf i t si nw i t ht h en a t u r a l r e g u l a t i o no fp l a n t sc a u s e db yt h ed i f f e r e n c e so fp r a c t i c a lc o n d i t i o n ss u c ha sv a r i e t i e s a n dt h ee n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：p l a n t s e l e n i u m s p e c i a t i o na n a l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盛壑堡王太堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作洲币虢范爷威 学位论文作者签名。仟坡嘬 m 年口j ，月? 4 e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盛壑堡王太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权盛壑堡王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 躲秘琅 砷年o f 月雩4 日 第1 章引言 第1 章引言 1 1 研究意义 随着人民生活水平的提高，食品的营养质量和健康质量日益受到重视，营 养学家j 下关注着植物性食品在人类健康中的作用。即使是以动物性食品为主的国 家或民族，其所需的营养元素的一半也来自植物。一旦产品中缺少c a 、z n 、f e 、 s e 、维生素等成分时，对人体健康将造成直接影响。 我们知道，1 8 1 7 年瑞典化学家b e r z e l i u s 发现了元素硒。1 8 5 7 年以后，人 们逐渐认识到硒( s e ) 是动物和人体必需的微量元素之一，是红细胞中谷胱甘肽过 氧化物酶的必需成分，并以此形成与生骨酚相互协同发挥抗氧化作用，即防止不 饱和脂肪酸中双键的氧化，使细胞膜避免过氧化物损害。估计人体含硒约 1 4 2 0 m g ，主要分布于肺、肝、皮肤、肾、毛发等中，其中的1 3 存在于肌肉尤 其是心肌中，在血液中的含量约卜l o 仙m o l l “1 。 硒还具有防癌抗癌，清除体内自由基，抗衰老的作用，而缺硒会引起人类 很多疾病，如贫血、冠心病、大骨节病、克山病、糖尿病等大约有4 0 余种疾病 与缺硒有关。同时硒对机体又有一定的毒害，毒性的大小与其化学形态有关0 1 。 硒在生态环境中的迁移、转化及生物有效性均与其赋存状态密切相关，人体中硒 主要从日常饮食中获得，因此，食物中硒的含量直接影响了人们日常硒的摄入量。 而食物硒含量受地理因素影响很大，土壤中硒的不同分布量造成各地食品中硒含 量的极大差异。 1 9 8 8 年1 0 月，对于硒的开发应用是一个关键的转折点。在中国营养学会第 五届全国营养学术会议上硒被正式纳入人类营养元素大家庭。专家建议中国出生 婴儿( 初生1 2 个月) 每同膳食中硒的摄取量标准是1 5pg ，l 3 岁儿童每同摄 取标准是2 0 1 1g ，3 6 岁儿童标准是4 0 ug ，7 岁以上直到成人每同摄取标准均 为5 0 1 1g 。成人硒的安全摄入量为5 0 ug 日，此标准己被美国采用。 据不完全统计，全世界有4 2 个国家和地区缺硒，如图1 - 1 所示，我国有三分 之二的地区约7 亿人口处于缺硒状态。中国营养学会对我国1 3 个省市做过一项调 查表明，成人日平均硒摄入为2 6 3 2 微克，离中国营养学会推荐的最低限度5 0 微克相差甚远。 鉴于硒的重要生理功能和广泛的药理作用，寻求一种安全高效的补硒形式 一直是人们关心的热门课题。七十年代初，我国克山病研究工作者发现克山病与 人群处于贫硒状态有关，以及硒对克山病发病有预防作用，曾用无机硒( 亚硒酸 钠) 的补硒方法防治克山病，取得了重大成果，但是由于无机硒毒性高，补充无 机硒制剂的补硒方式受到了很大的限制，而研究表明：植物有机硒是安全有效的 补硒形式。进入九十年代，硒的开发进入一个崭新的时代。在巩固和发展硒在牲 成都理l ：人学硕十学位论文 畜医疗、营养以及人类医疗成果的基础上，全面地、大幅度地开展人类营养食品 的开发。对硒的开发利用，从直接针对家畜转向面对人类，由医疗预防转向营养 保健。实验发现，硒生物效力是氧化硒盐( 无机硒) 的l o 一2 0 倍。也正因为如此， 人类对硒的开发利用，逐渐由无机态拓展到有机态。因此，寻找有机硒资源成了 国内学者的重要课题。但由于天然生长的生物体中硒的含量一般较低，加之硒化 合物的不稳定性等因素，已经发现的天然含硒化合物类型仍很少，生物有机硒的 形态研究工作还有待深入。1 。因此，利用富硒资源开发生产天然富硒食品，尤其 是开发天然有机硒保健食品，已成为目前我国富硒保健食品的重点。 图1 1我国缺硒地区分布情况图 从2 0 世纪7 0 年代开始，国内就有人进行了某些生物载体的富硒培养工作， 如富硒大蒜、富硒螺旋藻、富硒茶叶、富硒酵母、富硒中草药等，但绝大部分的 富硒培养研究工作仅涉及培养条件及产品中总硒、有机态和无机态的总量测定， 很少与硒的各种具体形态研究等紧密结合而深入研究。 当前，对生物体中有机硒的含硒生物分子研究依然是生物无机化学家关注 的热门课题，到现在为止，已发现了含硒蛋白、含硒多糖、含硒核酸、含硒氨基 酸等许多含硒生物分子，而以含硒蛋白质的研究最多，也更全面和深入。预计这 将是未来有关硒的研究一个很有潜力的重要方向。 综上所述：硒形态研究在环境科学和生命科学等领域具有重要意义，本课题 主要针对富硒生物样品中硒的各种形态进行定量分析，以期全面了解富硒产品中 硒的形态分布规律，为富硒产品的生产、开发和利用提供有益的参考。 2 第1 章引言 1 2 研究现状 1 2 1 硒的生物学效应】 硒是人体必需的微量元素之一。长期以来，人们都认为硒是一种毒性很大 的元素，直到1 9 5 7 年才证实硒以低浓度存在时，有助于防止肝坏死，并能促使 人和动物的生长，由此才将其列为一种生命必需微量元素。硒在生物体内主要以 有机硒化合物的形式存在。主要有两类：一类是含硒氨基酸，另一类是含硒蛋白 质。硒代氨基酸最主要的是硒代胱氨酸( s e - c y s ) 和硒代蛋氨酸( s e - m e t ) ，含硒蛋 白质中最主要的是谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 。硒代半胱氨酸是多种酶辅基的 必需成分，特别是谷胱甘肽过氧化物酶在对抗体内有氧代谢过程中所产生过氧化 氢对细胞( 亚铁血红蛋白) 的破坏作用时硒必不可少。 硒最主要的生物学功能是构成谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分，催化还原 型谷胱甘肽变成氧化型谷胱甘肽，使有毒的过氧化物变成无毒的羟基化物。过氧 化物在g s h p x 的催化下被分解，从而保护细胞及其组织不被过氧化物损伤，特 别是保护细胞器的膜，如线粒体，微粒体溶酶体的膜，硒和维生素e 都是抗氧化 剂，它们之间具有协同作用。此外硒参与辅酶q 的合成，拮抗有毒元素，能在体 内使有毒的金属如汞、铅、砷、镉等失活，还可通过三种免疫方式即细胞免疫， 体液免疫，非特异性免疫使免疫系统功能得到改善，从而增强免疫细胞的功能。 1 2 2 植物中硒的研究现状 人类自1 9 3 2 年在植物中检测出硒后，历经几十年，逐渐认识到硒是人体和 动物的必需微量元素，它的不足与过量都会使机体产生多种疾病。为此，1 9 8 8 年1 0 月中国营养学会规定硒的r d a 值为5 0 垤。但是，硒是否为植物所必需目前 尚无定论”。近年来，随着硒的免疫机制和生物抗氧化作用，尤其是与癌症和衰 老有关的生物自由基理论研究不断深入，人们对硒的认识已提高到一个新的高 度。尽管至今硒在植物营养上的功能仍不能确切阐明，但有关硒在植物体中的形 态及其在生命活动中的作用等研究已取得了一定的成果。 1 2 2 1 植物体中硒的含量和存在形态 植物中硒的含量变幅很大，因植物种类而异，从几个“g k g 到几千m g k g 。 根据不同植物积累硒能力的不同，可把植物分为聚硒植物和非聚硒植物。聚硒植 物可作为硒指示植物，如黄芪属( a s t r a g a l u s ) 植物，硒含量为l l o g k g 嘲。大 部分农作物属非聚硒植物，含硒量不超过3 0 m g k g ，不同作物对硒的吸收和富集 能力又有很大差异。一般作物中，十字花科植物对硒的积累能力最强，其次是豆 科植物，谷类植物最低，谷类中以小麦对硒的积聚最强，其含硒量是油菜籽 大 豆 小麦 蚕豆，蚕豆、豌豆、玉米和甘薯的含硒量均低于0 0 5 m g k g ，卷心菜 也有较多的硒积累。同一种作物的不同器官硒含量也存在很大差异，粮食作物中 成都理i ：人学硕十学位论文 籽粒或种子的含硒量大于茎秆，而在蔬菜作物中，非可食性部位中硒含量最高， 并且在种子成热期，大部分可溶性硒化合物被转移到豆夹或种子中。 植物组织中的硒分为有机硒和无机硒。植物中的有机硒形式是多种多样的， 硒能以低分子量化合物( 包括游离s e ) 和高分子量化合物形式存在于生物体内。 在植物体内的小分子形式主要是硒代氨基酸及其衍生物，如硒代胱胧氨酸、硒代 胱氨酸、硒一甲基硒代半胱氨酸、硒代高胱氨酸、硒代蛋氨酸等。硒代氨基酸形 式在聚硒和非聚硒植物之间有明显差异，前者以硒一甲基硒代半胱氨酸为主，同 时存在硒代高胱氨酸：后者则以硒蛋氨酸为主，同时含有硒肽；以大分子形式存 在的硒则包括硒蛋白、含硒核糖核酸、核多糖等。1 。如蛋白质硒是茶叶中硒的主 要成分，占8 0 左右，其中除少量与色素、多酚、核酸和果胶呈结合态外，其 余大部分的硒蛋白均呈游离状态。硒蛋白中占硒总量2 1 9 l 的硒为硒代甲硫氨 酸，无机硒仅占总量的8 左右“”。总的来说植物体内无机硒含量较少，主要以 s e ( z v ) 形式存在。大部分为有机硒，占总量的8 0 以上，其中又以蛋白硒为主。 1 2 2 2 植物体中硒的吸收和转化 植物吸收硒的主要来源是土壤中的硒。植物对土壤中硒的吸收与植物种类、 土壤硒含量、土壤质地、p h 值、土壤氧化还原电位、土壤水分含量、盐度等因 素有关。j o h n s s o n “”发现硒吸收在沙质中最高，随粘土含量增加而下降。 h a y g a r t h “4 等发现土壤p h 为6 0 时，草类叶从土壤吸收4 7 的硒；p h 为7 0 时，可吸收7 0 的硒。不同形式的硒化合物为植物根部不同的活性位点所吸收， 其活性吸收位点也可能不同。 a s h e r “”用7 5 s e 示踪法和色谱法证实植物体内转移的硒是硒酸根形态，用亚硒 酸盐供给植物，在根部被吸收并转化为硒酸盐和未知形态的硒化合物后向地上部 运输至叶片，在那里由无机硒转化为有机硒，这一转化过程不如根吸收过程快， 因此，根内常累积高浓度的硒。 1 2 2 3 植物硒的生理作用和功能 影响植物生长发育及农作物的品质。一般情况下，硒在植物体内的浓度为 0 0 0 4 0 2 m g k g 时认为是有益元素。硒在低浓度时( 0 0 0 1 0 0 5 0 u g g ) 时能刺 激农作物生长，过量则对植物起毒害作用“。硒影响农作物的品质主要是通过在 一定程度上影响作物体内有些有机化合物的水平来实现的。 抗真菌病害。硒能抑制真菌，与杀菌剂起协同作用。从腐烂的香蕉和番茄中 分离出的真菌，能够耐受较高剂量的杀菌剂代森一m 4 5 ，当加入硒后，较少数量的 杀菌剂就可以抑制真菌。 抗氧化作用。硒是谷光甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 的组成成分，g s h p x 可降 低或消除脂氢过氧化物所产生的自由基对膜的攻击能力，使膜免受过氧化损害而 4 第1 章引言 得到保护。 拮抗环境毒害。硒可预防镉中毒，拮抗汞和砷引起的毒性，从而能够增强植 物对重金属、环境污染物和生理逆境的抵抗力。如硒可降低小麦和莴苣对镉的吸 收，亚硒酸盐对镉的拮抗作用比硒酸盐更有效等；汞抑制小麦幼苗过氧化氢酶活 性，而硒能拮抗汞的毒性，以1 5 “g g 的效果较好”1 ，有人认为硒可能与汞形成 h g s e 复合物，从而减轻植物整体的汞负担。 与叶绿素的合成有关。单独施硒能增加叶绿素含量。研究表明，硒能调节豆 苗中卟啉的生物合成。因为叶绿素的形成与原卟啉- i x 、m g 一原卟啉脂有关，从而 影响叶绿素的合成。硒对叶绿素的合成起调节作用可能与它和巯基的两个酶作用 有关n 5 1 。 1 2 2 4 提高植物硒舍量的途径 目前，给植物施硒多为无机硒盐，硒肥应选用亚硒酸赫为好。因为作物对硒 酸盐反应较为敏感，其浓度稍高( o 5 2 5 m g k g ) 作物即可出现减产现象且易 使植物体内的含硒量过高。使用硒肥有土施、叶面喷施、浸种或拌种等方法。 世界上有4 0 多个国家和地区缺硒，我国有7 2 的县是低硒或缺硒地区。为 达到动物和人体应有硒的摄入量，可通过使用硒肥提高牧草词料及粮食和经济作 物的硒含量以达到补硒的目的。植物硒是食物硒的重要来源，它的生物利用率与 硒来自自然的高硒区还是来自施加的硒肥无关，并且植物硒比动物硒产品的生物 利用率高，它的有机硒比无机硒更安全有效。因此在缺硒地区，给土壤或作物施 硒肥提高粮食中的硒含量，解决人体和动物硒营养缺乏的根木措施，进而为解决 目前富硒产品中存在的富硒载体不适当、富硒途径不合理及硒含量指标失控等问 题提供参考。 1 2 3 两种富硒植物的简介 富硒植物是指能富集土壤中大量硒的植物称为集硒植物或富硒植物。植物 有机硒是人类营养硒来源的基本渠道，即使部分来自动物等副食品，从食物链的 角度看，它还是来自植物硒源，因此，植物硒资源的状况直接地影响到人类的硒 营养状况0 1 。对植物硒的研究，在营养学中极具重要的意义。同时，关于各种植 物对无机硒的有机化作用，富硒植物中硒的形态，含硒生物分子的分离、提取、 结构研究与生物医药活性研究等在医药和营养保健品开发方面也逐渐显示出其 潜在的应用价值。现就本课题研究的植物样品进行简要介绍。 1 2 3 1大蒜的成分及研究现状 大蒜( a l l i u ms a t i v u ml ) 系百合科葱属植物，原产于亚洲西部，汉朝时代 由张骞从西域引入我国，现在我国各地均有栽培，种质资源丰富，种植面积大， 品质优良，是我国人民普遍食用的传统蔬菜和重要的调味品。大蒜作为一种特殊 成都理i ：人学硕十学位论文 蔬菜，不仅含有丰富的维生素、氨基酸、矿质元素等营养成分，而且含有特殊的 抗菌、抗癌等活性物质( 见表卜1 、1 - 2 ) ，被认为是重要的天然保健食品“”。 表1 - 1 每l o o g 普通新鲜大蒜鳞茎成分含量 大蒜本身对硒的富集能力较强，其体内硒含量常常是一般蔬菜的2 0 一3 0 倍 1 7 - 1 8 ，而富硒大蒜的硒含量则可能是同一生长环境下普通大蒜的2 0 5 0 倍。同 时，大蒜还具有许多特殊的功能如抗菌抗病毒、降血压、抗血小板聚集、降血脂、 抗动脉粥样硬化及较强的抗衰老、防腐和抑瘤功能。在美国癌症研究院毒物学家 皮尔逊制定的“防癌名牌食品研究计划”中，大蒜与中国的绿茶被列入首选食物。 美国宾夕法尼亚州立大学营养系主任约翰密尔薪研究大蒜已经1 0 年，在做过 很多科学试验后，得出结论说：“没有比这种小瓣瓣( 指大蒜) 更有用的了。” 我国是世界上最大的大蒜生产和消费国，大蒜资源特别丰富，年产量占全 世界1 4 ，2 0 0 4 年的产量为1 0 0 万吨。大蒜产品出口量占蔬菜总出口量的1 5 左 右，在出口换汇的蔬菜中位居榜首。大蒜作为一种主要的调味食品，作为一种理 想的补硒天然食物，在其食用营养价值和药用健康价值方面，历来是人们研究的 重点。 但在诸多大蒜的研究中，主要集中在对大蒜的有效营养成分大蒜素的分离、 提纯和各种组分的鉴定等，对大蒜的富硒作用的研究也主要集中在富硒大蒜对人 体的肠道癌和乳腺癌等的防治和治疗方面的功用，以及其生长过程中各部位对硒 的吸收量的测定研究，但从分析化学的角度，单独对某一地区富硒大蒜产品中硒 的各种形态进行系统分析和研究则较少，同时对大蒜的有机硒的形态的深入研究 6 第1 章引言 的文献则更少。 1 2 3 2 螺旋藻的成分及研究现状 螺旋藻，是一种多细胞丝状海藻，属于原核藻类、蓝藻门、蓝藻纲，分为 三种主要类型：钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻。可生长在淡水、赫水、 海水及温泉中，喜高碱与适度盐分环境，为光合自养生物，适宜p h 值为8 3 1 0 3 ，温度为2 8 3 5 。 螺旋藻是2 0 世纪7 0 年代以来国际生物学工作者十分关注、广泛研究的一 种纯天然植物蛋白质资源；是目前已经开发利用的微藻中蛋白质含量最高、营养 最全面、适口性及消化吸收最好、安全性最高的食用藻种，被联合国食品会议确 认为“明天最好的食物”。研究表明：螺旋藻中含有极为丰富的营养成分和多种 生物活性物质，且成分均衡。其中含有的蛋白质可达6 0 8 0 ，并且螺旋藻蛋 白质中的氨基酸有1 7 种之多( 包括有8 种人体不能合成的必须氨基酸) ，此外， 螺旋藻中还含有螺旋藻多糖和b l 、民、b ：等1 0 多种维生素，锌、铁、镁等多种 矿物质，y 一亚麻酸、类胡萝h 素、叶绿素和多种酶类等生物活性物质。螺旋藻 及其提取物在防止青光眼、白内障，预防心脑血管疾病、增强肌体免疫力、抗辐 射、抗衰老、抗肿瘤等方面有明显的功效“”，而且可作为根除营养不良、预防和 治疗多种疾病的药物。螺旋藻及其多糖、多糖蛋白提取物对体外癌细胞具有抑制 作用。 目前，许多国家如墨西哥、美国、以色列和我国台湾对螺旋藻的生产与应 用已形成相当的规模。我国从“七五”计划开始也将螺旋藻作为重点科技攻关成 果和重点新技术项目加以推广，我国螺旋藻产业的发展正面临巨大挑战，还没能 解决产品深度加工的问题，需要进一步强化其医疗保健功能。依次对螺旋藻中各 种营养物质进行分离提纯并对其活性进行充分研究是给我们提出的一个重要的 课题。 1 2 4 硒的价态分析研究现状 微量元素的化学形态分析是当今科学研究的活动领域，也是环境科学、生 命科学对分析化学提出的一个挑战性课题。形态分析对揭示微量元素在环境和生 命科学中的迁移转化规律及其生物化学作用都是非常必要的，继s c h w a r z o ”证明 了硒的营养作用后，硒的独特生理功能越来越为人们所关注。 形态( s p e c i a t i o n ) 一词包含“状态”( s t a t e ) ，“形式”( f o r m ) 和“物种” 或“种形”( s p e c i e s ) 等含义。因此，形态分析不仅要区分其价态，而且还要区 分其无机态和有机态、离子态和非离子态等多种形态。硒的化学形态影响生物活 性，进而影响人类健康。随着对硒的毒性和营养功能研究的深入，人们越来越需 要了解硒的各种形态的具体可靠信息。 7 成都理i ：大学硕士学位论文 硒的测定需要将不同形态的硒变为适于测定形式，为此要对样品进行消化。 消化时要保证样品的硒全部转化为适于测定的形式，同时要尽可能避免硒的损 失。目前常用的方法是湿法消解，其常用o ”王水一高压消解罐法、h n 如- h 。s o 法、 o 。- h c l 矾法、h n 0 3 - h c i o 。- h f 法及其它消解体系法。总之，消化样品时，要根据 待测样品和检测技术的实际情况选择合适的消化方法。 环境样品和生物样品中硒的含量都很低，而硒的形态分析是同时测定各种形 态硒的分量，因此，除了少数灵敏度很高的分析方法外，分离富集是硒形态分析 必不可少的步骤。这不但可以提高待测痕量形态在原始基体中的摩尔分数，而且 可以减少基体干扰，从而最终延伸方法的检测下限。值得注意的是任何分离富集 步骤都应避免改变硒原来的各种化学形态之间的平衡。 1 2 4 1 硒的无机形态分析 硒在不同的条件下有四种氧化态：以s e ( - i i ) 存在的硒化物，如h s e + 、h 2 s e 以及金属硒化物，其中硒化氢有毒且不稳定，硒的金属化合物在土壤中可能是不 溶态的；以s e ( 0 ) 存在的单质硒非常稳定，但是很难溶，在溶液中可能以胶态存 在；以s e ( i v ) 存在的亚硒酸及其盐，如h s e o 。一、s e o 。；以s e ( v i ) 存在的硒酸盐 ( s e q 2 。) 很稳定，耐碱、耐氧化。 s e ( i v ) 的分析：s e ( i v ) 的分析方法有催光光度法o ”1 、荧光法( a f s ) 脚“1 、原 子吸收光谱法( 从s ) 3 2 - 3 7 、电感藕合等离子原予发射光谱( i c p - a e s ) 、溶出伏安 法、中子活化法( n a a ) “”及色谱法“1 等。大多数样品在检测前，要进行分离 富集。主要有溶剂萃取法、x a d 树脂分离技术、色谱技术、离子色谱分离法。目 前，检测方法以石墨炉原子吸收光谱法( g 从s ) 及与其联用的相关技术较为成熟。 其优点是样品前处理简单，而且可引入镍、钯等m “1 基体改进剂既可以提高硒的 灰化温度，又减少了硒的损失，提高了分析灵敏度。 总硒( s e ，) 的分析：测定总硒的常用方法是g 从s ，总硒测定大多数方法主要 是以s e ( i v ) 的反应为基础，因此，必须将有机硒及其它形式的无机硒预先转化 为s e ( i v ) ，将低价态的硒用较温和的氧化剂氧化成s e ( i v ) ，而将s e ( v i ) 用温和 还原剂还原成s e ( i v ) 。最常用的还原剂是盐酸，研究表明，盐酸的最佳浓度为4 7 m o l l ，还原温度9 0 1 0 0 ，时间2 0 4 0 m i n ，溶液中的s e ( v i ) 可还原完全， 如果反应时间太长，还原温度过高及h c l 浓度过大，可导致部分s e ( i v ) 以s e 0 2 c 1z 和s e o 。2 h c i 等形式挥发而损失。硒的谱线中，共振线s e l 9 6 o h m 是唯一被 选用的谱线。 s e ( v i ) 的分析：s e ( v i ) 的分析大多数是基于总硒与其它形式硒的差值以及直 接检测的s e ( i v ) 与还原后检测出的s e ( i v ) 的差值而得出。文献 4 9 向试样中加 入h c l 于1 2 0 w 微波炉中加热2 m i n 将s e ( v i ) 还原为s e ( i v ) ，消解液注入氢化物 8 第1 章引言 发生装髭中，用i c p - a e s 测定，检出限为s e ( v 1 ) 8 p g 、s e ( i v ) 6 p g 。l a r r a y aa 等1 用氧化铝填充柱预富集硒的各化学形态，并用氢化物发生原子吸收光谱法分 析了硒的各种无机形态。校正曲线为0 1 5 1 2 0 9 l 。 s e ( - i i ) 和s e ( 0 ) 总和的分析：其检测是基于总硒和s e ( v i ) 、s e ( i v ) 之差或 温和氧化试样前后s e ( i v ) 的差。 1 2 4 2 硒的有机形态分析 在绝大多数情况下，植物体内的硒都是以有机化合物形式存在“。硒的有 机形态主要以硒的蛋白质及其氨基酸、二甲基硒( d m s e ) 、二甲基二硒( d m d s e ) 、 三甲基硒离子( t m s e + ) 等形式存在。就整个生物界来看，动物、植物和微生物中 均己发现有硒蛋白存在。硒蛋白及其氨基酸在微生物或细菌的作用下可转化为易 挥发的d m s e 和d m i ) s e 6 0 。 挥发态有机硒化物分析：目前，由于对挥发态有机硒化物缺乏有效的分离富 集和检测技术。挥发态有机硒化物在自然界中含量极微，因此富集必不可少。近 年来有文献报道用固体吸附剂4 “1 、液氮补集技术富集嘞“，然后用热解吸或溶 剂萃取挥发态的有机硒化物进行检测。 色谱法是一种很好的分离方法，它与其它检测器联用，是一种强有力的形态 分析手段。与色谱法联用的检测器有原子吸收( 从s ) 、电子捕获( e c d ) 、质谱( m s ) 等。 有机硒蛋白及其氨基酸分析：随着人们对硒的独特生理功能的进一步认识和 了解，补硒将是缺硒病人的良好选择。而硒蛋白将是补硒制品的较好原料。因此 对硒蛋白的分离分析不仅对防治缺硒病症有重要意义，而且对于阐明缺硒病症的 发病机理具有重要意义。 硒蛋白的分离纯化方法有离子交换色谱、薄层色谱、凝胶色谱、气相色谱以 及电泳法等。陈汉杰等”7 1 综述了硒蛋白的分离方法。现代分析仪器的发展，大大 地推动了硒蛋白的分析。特别是色谱和检测技术的联用，使分离和检测硒代氨基 酸成为可能。 文献 5 8 用纸色谱法对硒的氨基酸进行鉴定，并用氨基酸分析仪测定常规氨 基酸组成。文献 5 9 用离子色谱微波消解氢化物发生原子吸收光谱法测定硒蛋氨 酸的校正曲线为1 0 3 1 0 0 0 i ig l 。近年来，发展了衍生法用以氨基酸的准确 分析。吴江等”用c n b r g c 法测定了结合态的硒蛋氨酸；文献 6 2 为提高分离 效率，发展了柱前衍生化法，用卜二甲基胶胺萘- 5 - 磺酰氯( d n s - c i ) 作衍生化试 剂，高效液相色谱法测定硒- 7 5 蛋氨酸，检出限为l o n g 。文献 6 3 用毛细管电泳 分离硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，检出限均为i m g l 一。文献 6 4 用反相高效液相 色谱一聚焦微波消化一氢化物原子吸收光谱法测定了多种硒代氨基酸。 9 成都理i ：人学硕+ 学位论文 1 2 5 硒的测定方法研究进展 1 2 5 1荧光法 荧光法的基本原理是在一定条件下将样品中不同形态硒转化为s e ( ) ，用 2 ，3 一二氨基萘( d a n ) 对s e ( ) 的选择性反应生成的s e d a n ，其荧光强度与硒浓度 在一定条件下成正比。用环己烷等有机溶剂萃取后于激发光波长3 7 6 n m ，发射光 波长5 2 0 n m 处测定荧光强度，与绘制标准曲线比较定量。它是现行中华人民共和 国国家标准中食品中硒含量的测定方法( 第一法) ，该方法灵敏、准确，但是所用 试剂有毒，硒与d a n 的反应条件( 如p h 值、温度) 要求严格，操作较为繁琐。 k y o d e ny 等狮用此法测定了大豆中总硒。谢申猛等1 收集不同硒水平地区 的大豆，分别测定了大豆粉、脱脂大豆粉、固体残渣、l l s 蛋白、7 s 蛋白、乳清 蛋白、液体残留物中硒的含量。目前用于荧光体系的有机配合物有很多，如3 一 溴一5 一三氟甲基- 1 ，2 - - - - 氨基苯反应“”、4 一硝基一1 ，2 - 二氨基苯反应1 等。 路丹红呻1 等提出利用b - c d 和s d s 对s e d a n 的协同增敏作用不经萃取在水溶 液中直接测定痕量硒，谢剑炜3 等利用b _ c d 和1 ，2 - b p ( 1 ，2 - 二溴丙烷) 测定麦粉 中痕量硒，均获得满意结果。秦方“则采用荧光二阶导数法进行硒的定量测定， 使得测定结果更为准确。 荧光法是测定硒的经典方法，具有灵敏度高的优点，但该法操作繁琐费时。 1 2 5 2 原子吸收光谱法 原子吸收光谱法是基于物质所产生的原子蒸汽对特定谱线的吸收作用来进 行定量分析的一种方法。用原子吸收分光光度法测定微量硒近几年发展较快，为 提高灵敏度和精确度，在技术方面的改进大致如下：( 1 ) 选择适当的基体改进剂； ( 2 ) 采用平台石墨技术；( 3 ) 采用氢化物发生技术。 石墨炉原子吸收光谱法存在硒的挥发损失、干扰等问题。张奇、李海涛、杨 锦发等1 在用石墨炉原子吸收法测定样品中硒时采用不同的基体改进剂均获得 较好的效果。王宏m 1 采用石墨炉平台技术和塞曼扣背景系统消除基体干扰，并用 铜基体改进剂，测定了鸡蛋中微量硒，也获得满意结果。 氢化物石墨炉原子吸收光谱法是近年来发展起来的一项技术。它使测定元素 转化成气态氢化物与基体分离，受干扰较小、灵敏度高、重现性好。马玉平” 将流动注射技术与之结合，克服了间歇式氢化物发生器操作复杂，测定速度慢的 缺点，使该法的实用价值得到提高。样品不经分离，直接进样测定。刘波静” 等用氢化物原子吸收法测定螺旋藻中痕量硒，结果令人满意。该方法下限可达 1 7 n g g 一，样品回收率为9 8 8 1 0 1 2 0 。 1 2 5 3 氢化物原子荧光光谱“ 法( h g - a f s ) 氢化物原子荧光光谱法原理是将样品中硒转化为s e ( ) ，用n a b i l 或k b h | 作还 l o 第1 章引言 原剂，将s e ( ) 在h c l 介质中还原成s e 地，由载气带入原子化器中进行原子化， 在硒特制空心阴极灯照射下，基态硒原子被激发至高能态，在去活化回到基态时， 发射出特征波长的荧光，其荧光强度与硒含量成正比。氢化物原子荧光光谱法， 测定生物样品中硒的准确度高、灵敏度、精密度好，线性范围宽，所用试剂毒性 小，实用性强，已列入国标法。 1 2 5 4 电感偶合等离子体光谱法( i c p a e s ) 在任何高温气体中，如有1 以上原子或分子被电离，该气体即具有相当大的 电导率，这种自由电子、离子和中性原子或分子组成的中性气体，即称为等离子 体。h g i c p - a e s 已广泛应用于啤酒、蜂蜜、猪肉中痕量硒的分析口6 1 。在天然药物 中该法也常被使用。 1 2 5 5 催化吸光光度法( c s 舢 催化光度法是目前较常用的测硒方法，利用s e ( ) 能够催化k c l 0 。氧化苯肼 生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料，生成的红色偶氮染料的吸光 度与一定量范围的硒成正比，因而可利用催化吸光光度法测s e ( ) 的量。但其中 有的方法操作繁琐费时，有的方法普遍使用了被怀疑为有致癌危险性的肼类、萘 胺类等物质。郝素娥”7 1 采用此法测定了硒酵母中硒的含量。许卉等m 1 也利用c s a 法测定了海产品中痕量硒。 1 2 5 6 紫外可见吸光光度法 目前，用于硒的形态分析的吸光光度法中，高灵敏、高选择性的显色剂和显 色体系的研究是两个主要方向。李保林1 等利用s e ( ) 与d a b 的络合显色反应， 用紫外吸光光度法测定硒。贺萍1 等采用双硫腙- c c l 。萃取吸光光度法测定海产 品中痕量硒。胡利娟9 ”用硒一硫氰酸钾一罗丹明b 一明胶一0 p 体系吸光光度法测定微 量硒。 1 2 5 7 化学发光猝灭法( c e m ) 利用硒对鲁米诺一过氧化氢一高锰酸钾发光体系的阻化作用，实现化学猝灭法 测定微量硒。李建国等啪1 利用s e ( ) 与i 一反应生成1 3 ，而i 。一使罗丹明6 g 荧光 猝灭，建立了间接测定s e ( ) 含量的荧光猝灭法。 1 2 5 8 电分析法 近十多年来硒的电化学分析法发展较快，诸如电位滴定法、溶出伏安法、催 化极谱法、离子选择电极法等。其中在硒分析中应用较多的是极谱法和溶出伏安 法。极谱法和溶出伏安法是特殊条件下进行的电解分析法，具有仪器简单、灵敏 度高、准确度高、分析速度快、应用范围广等特点。用催化极谱法测定蚂蚁及其 制剂中的硒，示波极谱法测定植物药类中的硒等均已得到满意效果。随着科学的 发展，极谱法和溶出伏安法等电分析方法将是很有前途的。 成都理j ：人学硕十学位论文 1 2 5 9中子活化分析法( n a a ) 中子活化分析技术近年来在不断发展且同趋完善，适用