黄鳝肠道益生乳酸菌的筛选与鉴定 水产毕业论文.doc

海 南 大 学毕 业 论 文（设计）题目：黄鳝肠道益生乳酸菌的筛选与鉴定学号：姓名：年级：2009级学院：海洋学院系别：水产系专业：水产养殖学指导教师：完成日期：2013年5月18日iii摘要黄鳝（mponopterus albus）隶属合鳃目、合鳃科、黄鳝亚科，为亚热带淡水鱼类，主要分布在亚洲的中国、朝鲜、泰国、日本、印度尼西亚等国家，具有良好的药用保健功能，有很高的经济和营养价值。本文以黄鳝为研究对象，通过对其肠道菌群采用“先筛选后分离”的方法，旨在获得黄鳝肠道益生乳酸菌。结果获得3株菌株，命名为lb-1，lb-2，和lb-3，初步确定为乳酸菌。随后对三株乳酸菌进行抗逆性分析，结果如下：三株乳酸菌均可以在酸性和碱性条件下存活；胰蛋白酶对三株菌的存活率没有影响；在70的高温中三株菌均有一定的耐受性。本文从黄鳝肠道中筛选出具有耐高温、抗酸和抗碱能力强的益生乳酸菌，以其作为黄鳝饲料添加剂应用于生产，以提高黄鳝机体的健康水平和机体的抗病力，从而为促进黄鳝养殖产业的健康发展奠定基础。关键词：黄鳝；肠道益生乳酸菌；筛选abstractthe rice-field eel (monopterus albus) a member of the synbranchiformes, synbranchidae, rice field eel subfamily, is a subtropical freshwater fish that occurs mainly in asia, including china, japan, korea, thailand, indonesia and other countries. this fish has certain properties useful for medical purposes and is also of very high economic and nutritional value. based on eel as the research object, through the intestinal flora with the method of separation after first screening, aims to obtain eels live lactic acid bacteria in the gut. the results obtained from three strains, and named the lb - 1, lb - 2, and lb - 3, initially identified as lactobacillus. then analysis of three strains of lactic acid bacteria for stress resistance.this study yielded the following results: (1) acidity resistance: the 3 strains of lactic acid bacteria were able to survive in acidic and alkaline conditions; (2) parenzyme resistance: variations in parenzymes had no effect on the 3 strains of bacteria; (3) temperature resistance: the 3 strains of bacteria were able to tolerate up to 70 . the purpose of this study is to study is study strategies of building the rice-field eels resistance to disease through nutritional additives. this study will study samples of probiotic lactic acid bacteria resistant to high temperature, acid and alkali that commonly occur in the eels intestinal tract, in order to if certain feed additives can combat bacterial growth and promote healthy eel growth. key words：monopterus albus; the intestinal probiotic lactic acid bacteria; selecte目录前言11 材料与方法11.1 材料11.1.1 试验动物11.1.2 培养基21.1.3 试剂21.1.4 主要仪器设备21.2 方法31.2.1 样本的采取31.2.2 菌种的分离及初筛31.2.3 乳酸菌的抗逆性试验42 结果52.1 乳酸菌筛选结果52.2 乳酸菌抗逆性实验结果72.2.1 ph值对乳酸菌的影响72.2.2蛋白酶对三株乳酸菌存活率的影响72.2.3 高温对乳酸菌存活的影响83 结论与讨论9致谢11参考文献12黄鳝肠道益生乳酸菌的筛选与鉴定前言黄鳝（mponopterus albus)隶属合鳃目、合鳃科、黄鳝亚科，为亚热带淡水鱼类，主要分布在亚洲的中国、朝鲜、泰国、日本、印度尼西亚等国家，具有良好的药用保健功能，有很高的经济和营养价值。但随着养殖密度的加大，黄鳝的发病率越来越高，抗生素药物的使用日益增多。抗生素作为饲料添加剂使用以来，其饲用效果已被证实，尽管在一定程度上可以预防疾病，甚至提高养殖动物生长速度，但随之带来的一系列诸如耐药性、环境污染等问题也日益受到人们的重视。目前，各国政府已纷纷出台措施，严格控制抗生素作为饲料添加剂的使用，因此出现了开发抗生素替代品的研究热潮。动物微生态理论认为，动物及体内所寄生的微生物相互作用、相互影响；在环境因素的影响下，动物与微生物保持动态的微生态平衡；正常微生物群的组成存在种属和个体特异性；特定的环境条件可造成动物微生态失调，使生态系统丧失功能；动物和微生物群之间存在共生关系，互相提供营养等生存条件等1。益生菌剂是利用宿主的正常菌群制成的，以达到调整宿主微生态平衡为目的2。乳酸菌作为一类能利用碳水化合物发酵并产生大量乳酸的细菌，是动物肠道内正常菌群不可缺少的组成部分，对维持肠道正常菌群的微生态平衡和提升宿主免疫力等均具有重要作用。乳酸菌不仅能够分泌丰富的酶源，促进宿主肠道对营养物质的吸收和利用，而且可通过加强宿主机体肠道微生物的屏障作用，间接提高宿主对病原抵抗力，从而提高宿主动物的健康水平和抗病力，进而提高养殖动物的成活率3。近年来，筛选益生菌，研究其与动物肠道菌群和生长的相互关系，是益生菌研究的一个重要方面。本研究以黄鳝为研究对象，旨在从其肠道中筛选出具有耐高温、抗酸和抗碱能力强的益生乳酸菌，以其作为黄鳝饲料添加剂应用于生产，以提高黄鳝机体的健康水平和机体的抗病力，从而为促进黄鳝养殖产业的健康发展奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物试验用健康黄鳝，重量20020g/尾，采自海口某黄鳝养殖场。1.1.2 培养基表1.培养基配方培养基成分mrs培养基蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，吐温-80 0.5ml，磷酸氢二钾1.0g，含水醋酸钠2.5g，柠檬酸氨1.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.025g，琼脂粉 7.5g，蒸馏水加至500ml，调ph值6.2-6.6， 12l 15min高压灭菌。mrs肉汤培养基蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10.0g，吐温-80 0.5ml，磷酸氢二钾1.0g，柠檬酸铵1.0g，硫酸镁0.1g，蒸馏水加至500ml，调ph值6.2-6.6， 121oc 15min高压灭菌。酸化胆盐mrs培养基在mrs培养基的基础上加0.2%乳糖胆盐，调ph值至 5.6， 12l，15min高压灭菌。1.1.3 试剂无菌pbs（两份）：0.1mol/l磷酸氢二钠 46.3ml与0.1mol/l磷酸二氢钠 53.7ml混合，调ph为6.2；草酸铵结晶紫：溶液a（结晶紫 1.0g ，95%酒精 20ml），溶液b（草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml），混合过滤使用；卢戈氏碘液：碘片 1.0g，碘化钾 2.0g，蒸馏水 300ml（提前24h配制），5%番红复染液，3%过氧化氢(现配现用)，95%酒精，50%甘油（灭菌）；溴甲酚紫指示剂：0.04g溴甲酚紫，2ml乙醇；其他试剂及药品均为分析纯。1.1.4 主要仪器设备酸度计：上海大普仪器有限公司phs-29a高速冷冻离心机：德国 eppendorf centrifuge 5810r电子天平： 梅特勒 托利多仪器(上海)有限公司al104电热恒温干燥箱：上海跃进医疗仪器厂gzx-dh-30x35-bs蒸汽灭菌器：日本sanyo mls-3780恒温恒湿培养箱：重庆市永生实验仪器厂xmt-9017净化工作台：上海苏净实业有限公司 bcm-1000光源显微镜：江南光电集团有限公司 xs-213-201厌氧培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司 yqx-11电子恒温水浴锅：天津泰斯特有限公司cwca碎花制冰机：日本sanyo sim-f140恒温震荡摇床： 日本sanyo orbi-safe1.2 方法1.2.1 样本的采集参考于文媛，王世锋等8无菌提取合浦珠母贝抗菌肽粗提液制备方法，加以修改如下：将健康的黄鳝置清水池暂养。取样时，将黄鳝置于冰浴中麻醉后，用酒精棉消毒鱼体表面，无菌打开腹腔，消毒肠管外壁，并用无菌pbs冲洗数遍，取肠道，加入适量pbs后匀浆，制成原液，置于4冰箱中密封保存备用。1.2.2 菌种的分离及初筛参考单晓枫4分离鲤鱼肠道乳酸菌的方法，将原液用无菌pbs进行倍比稀释，制成原液、10-1、10-2、10-3四个梯度稀释液。取各稀释液0.1ml，分别涂布于酸化胆盐mrs培养基，封口膜封板后，30厌氧培养48h，至长出单菌落。挑取不同单菌落接种于mrs肉汤培养基，30，180rmp摇床震荡，厌氧培养18h。1.2.2.1 触酶试验参考单晓枫5触酶试验的方法改进如下：在超净工作台上，取msr肉汤培养基培养的菌液少量置于洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢一滴，观察结果，淘汰产生气泡，即触酶阳性的细菌。对触酶阴性的菌液进行离心（4，4000转，15min），除去上清备用。1.2.2.2 革兰氏染色参考周德庆等6编写的微生物学实验教程关于革兰氏染色的方法。（1）涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪枪头挑取少量待检样品（离心沉淀菌体）滴在载玻片的中央，将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。（2）干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。（3）固定：手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60），放置待冷后，进行染色。（4）初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色1min。（5）水洗：斜置载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。（6）媒染：用胶头滴管吸取卢戈氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色1min。（7）脱色：斜置载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。（8）脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不显紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。（9）复染：在涂片薄膜上滴加番红复染液1-2滴，使染色液完全覆盖涂片，染色1min。（10）水洗：斜置载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。（11）干燥观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴松柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。对分离出的触酶阴性菌进行革兰氏染色，镜检。对触酶阴性、革兰氏阳性的球菌及杆菌，可暂定为乳酸菌， 50%甘油：菌悬液=1：1，-20密封保存。1.2.2.3 葡萄糖产酸试验参考卢晓莉7产酸试验方法修改如下：在装有液体mrs培养基的试管中加入浓度为1.69g/100ml的溴甲酚紫作为指示剂，添加量为 1.4ml/l。接入菌株（1.2.2.2保种），30培养24h，180rmp摇床震荡培养。若培养基的颜色由紫色变为黄色，则证明有酸产生。将产生酸的对应的菌种暂定为乳酸菌，进行保种。1.2.3 乳酸菌的抗逆性试验参考单晓枫5，卢晓莉7，贺中华8等进行乳酸菌抗逆性试验，具体操作的方法如下：1.2.3.1 乳酸菌的活化将1.2.2.3分离到的乳酸菌接种于mrs肉汤中，30，18h，180rmp震荡培养，进行活化。取培养液于4，4000rmp，离心15min后，用无菌pbs悬浮沉淀菌体，调菌体含量为一定浓度，备用。1.2.3.2 ph值对乳酸菌的影响用1mol/lhcl、lmol/l naoh调节pbs溶液中，使其ph值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、8.0、9.0和10.0，并将未调ph值的pbs溶液(ph6.2)设为对照。灭菌。取1.2.3.1保留的乳酸菌进行活化，按5%(v/v)接种于上述培养基中，30厌氧条件下培养，在接种0h、1h、2h、3h、4h后，取上述处理菌液0.lml，分别涂布于酸化胆盐mrs培养基，封口膜封板后，30厌氧培养48h，至长出单菌落，用细菌计数板进行平板计数，观察其对酸碱的耐受情况。1.2.3.4 蛋白酶对乳酸菌存活率的影响取活化好的乳酸菌，按5%(v/v)接种于浓度为1%的胰蛋白酶的pbs溶液中，以未加蛋白酶的pbs溶液作为对照，于30厌氧培养，分别在0h、lh、2h、3h、4h时取处理样进行平板计数，观察蛋白酶对乳酸菌存活率的影响。1.2.3.5 耐高温能力的测定通过上述试验所筛出的乳酸菌进行活化，按5%(v/v)接种于pbs溶液中，30厌氧条件培养4h后，取菌液进行高温处理：50、70、90各2min、5min、10min，以未经热处理的菌液作为对照。用平板计数估算菌液浓度，观察其耐高温的能力。2 结果2.1 乳酸菌筛选结果在酸化胆盐mrs培养基上培养出5种不同的菌落，分别为橘黄色、不透明、圆形、直径0.8-1.0mm、边缘整齐、表面光滑湿润；乳白色、不透明、圆形、直径2.0-2.2mm、边缘整齐、表面光滑湿润；乳白色、不透明、圆形、直径0.5mm、边缘整齐、表面光滑湿润；乳白色、不透明、圆形、直径3.0-3.2mm、边缘整齐、表面光滑湿润；淡黄色、不透明、圆形、直径0.5mm、边缘整齐、表面光滑湿润。从5种不同的菌落中挑取50株菌种接种在mrs培养基中，按1-50编号。将进行活化的50株菌株进行触酶实验，其中26株菌种触酶阴性，编号分别为9，11，12，13，14，15，16，18，25，26，28，29，31，32，33，34，35，37，38，39，40，42，43，44，45，48，具体结果见表2。在此基础上对26株菌株进行革兰氏染色观察，其中革兰氏阳性的有16株，编号为9，11，12，13，14，25，26，28，29，31，35，37，38，39，40，45，48，结果见表2。将16株菌株接种在加入浓度为1.69g/100ml的溴甲酚紫液体mrs培养基中进行葡萄糖产酸试验的筛选，结果表明共有3个培养基变为黄色，编号分别为11，16，26，依次命名为lb-1，lb-2，lb-3，初步确定为乳酸菌5，其他为紫色，体结果见表4。 表2.触酶试验结果编号结果编号结果编号结果编号结果编号结果1+11-21+31-41+2+12-22+32-42-3+13-23+33-43-4+14-24+34-44-5+15-25-35-45-6+16-26-36+46+7+17+27+37-47+8+18-28-38-48-9-19+29-39-49+10+20+30+40-50+标注：阳性+；阴性-表3.革兰氏染色镜检结果编号结果编号结果编号结果编号结果9+18-33-42+11+25-34-43+12+26+35-44+13+28-37-45+14+29+38+48+15+31-39-16+32-40+标注：阳性+；阴性-表4.葡萄糖产酸试验结果编号结果编号结果编号结果编号结果9142943111538441216404513264248 标注：紫色；黄色2.2 乳酸菌抗逆性实验结果2.2.1 ph值对乳酸菌的影响通过对三株菌在不同ph值条件下的生长情况分析如下：由表5可知，乳酸菌lb-1在ph=2时，随着培养时间的延长存活率下降；ph从3.0到9.0，乳酸菌lb-1在随着培养时间的延长，存活率在上升；在ph=10.0时，存活率成负增长。因此，可以判断乳酸菌lb-1在酸性和碱性条件下，以ph=6.2为对照，存活率都在50%以上，并且在ph=5.0时，最适宜生存。由表6可知，乳酸菌lb-2在ph=2时，随着培养时间的延长存活率下降。在ph从3.0到9.0，整体来说，乳酸菌lb-2在随着培养时间的延长，存活率在上升，在ph=10.0时，存活率成负增长。因此，可以判断乳酸菌lb-2在酸性和碱性条件下，以ph=6.2为对照，存活率都在50%以上。并且在ph=4.0时，最适宜生存。由表7可知，乳酸菌lb-3在ph=2和ph=3时，随着培养时间的延长存活率下降，并且耐强酸能力差。在ph从4.0到9.0，整体来说，乳酸菌lb-3在随着培养时间的延长，存活率在上升，在ph=10.0时，存活率成负增长。因此，可以判断乳酸菌lb-3在酸性和碱性条件下，以ph=6.2为对照，存活率都在50%以上。2.2.2蛋白酶对三株乳酸菌存活率的影响由表8可知，在加有胰蛋白酶的培养基中，随着时间的推移，乳酸菌lb-1，lb-2，lb-3的存活率基本上无变化，因此，可以判断，胰蛋白酶对3菌株没有影响。 表5.不同ph值对lb-1菌存活率的影响 单位： cfu/ml时间/hph2.03.04.05.06.2（对照）7.08.09.010.00h1.091064.361075.121071.041081.651082.231081.441081.311081.021081h1.821052.881074.161077.761071.441082.231081.041089.541082.071072h9.121033.311073.631071.311081.941082.391081.411081.381083.541073h1.051035.371076.161072.291082.631083.311081.811081.811089.771074h4896.451077.411073.631083.091084.891081.731081.731082.18106表6. 不同ph值对lb-2菌存活率的影响 单位：cfu/ml时间/hph2.03.04.05.06.2(对照)7.08.09.010.001.091061.951064.171071.051082.291083.021081.151081.151081.0210813.311037.761052.821077.241071.791082.291081.001089.771076.9210721.021034.271053.311079.551071.951082.691081.511081.451083.3110734.371031.051067.241071.451082.691083.891081.861081.411088.9110644.901031.621067.761071.781084.681085.751082.821081.821082.09106 表7.不同ph值对lb-3菌存活率的影响 单位： cfu/ml时间/hph2.03.04.05.06.2（对照）7.08.09.010.001.261061.411063.471074.681072.291081.051081.551081.411081.0010811.231051.051062.241072.881071.781089.121071.051081.151085.6210729.551039.121052.881073.311072.631081.021081.451081.411082.0410733891.021064.071077.081073.391081.741081.661081.581086.17106463.09.771054.901078.131074.901082.141082.451082.291081.051062.2.3 高温对乳酸菌存活的影响由表9可知， 乳酸菌lb-1，lb-2，lb-3在50时，存活率没有什么影响。乳酸菌lb-1在70时，随着培养时间的延长，存活率急剧降低，在培养10min时，基本上检测不到。乳酸菌lb-2，lb-3在70时，存活率也与培养时间成负相关，相对lb-1来说，对70的耐受性要强。3株菌株在90时，无法生存。表8.胰蛋白酶对三株菌存活率的影响 单位： cfu/ml时间/h菌株lb-1lb-2lb-302.081082.691082.6310812.511083.091082.8110822.631082.571082.4510832.881082.631082.6910842.691082.881083.09108表9.高温对乳酸菌存活的影响 单位：cfu/ml时间/min菌株lb-1菌株lb-2菌株lb-350709050709050709002.881083.011082.881082.291082.451082.081083.011082.881082.9510822.811083.98108102.451083.63108102.691082.951081053.6110819.9103.3810836.3103.3210836310103.0110810102.6910810.4102.6310818.1103 结论与讨论早在20 世纪 50 年代国外就已经开始研究鱼类肠道细菌9，而国内对鱼类肠道菌群的研究相对较晚，研究方向主要为鱼类肠道菌群中的细菌分离鉴定、病原菌和肠道菌群之间的关系、肠道菌群对宿主消化和生长发育的影响等10。通过给养殖动物投喂益生微生物制剂，研究有益微生物是否定植于肠道，以及对肠道菌群的调节能力，决定了益生微生物制剂的应用效果，因此，益生微生物制剂的使用与肠道菌群之间的关系成为近几年的研究热点。乳酸菌是鱼类肠道的正常菌群11，同时也是较常见益生微生物之一。在1989年美国的饲料控制官员协会(aafco)公布的认为安全的微生物菌种和1999年我国农业部公布的12种安全的益生素生产菌种中，乳酸菌占了其中的大半。根据目前的研究结果显示，在鱼类肠道中乳酸菌的种类主要乳酸杆菌和肉杆菌等12。乳酸菌制剂是一种具有天然活性的微生物制剂，具有无毒、无抗药性、无残留以及无副作用等符合健康养殖的特点，同时更具有促进动物生长、提高饲料转化率以及增强动物机体的免疫功能等功效，因此，已成为各水产养殖国家的研究热点13。目前，乳酸菌在鱼类如石斑鱼（epinephlus coioides）、舌齿鲈(dicentrarchus labrax)中的研究已有报道14-15，但未见黄鳝方面的研究。益生菌菌种的筛选是益生菌研究的的一个重要环节，直接关系到益生菌的应用效果。从宿主或周围环境中分离的益生菌的作用优于从相异种或从完全不同的生境中分离的益生菌15。本实验采用“先筛选后分离”的方式，直接从黄鳝肠道进行分离益生。为了得到安全性好，存活能力强，功能更全面的益生菌，筛选还可以包括以下的测试：对酸和胆汁盐的耐受性，产生各种消化酶的能力，碳水化合物，蛋白质和fe3+等营养物质的利用方式等16-19。鱼类肠道乳酸菌很复杂，并不使所有的乳酸菌都具有益生菌的特性，将分离用的培养基酸化，可以排除一些不耐酸的菌株；而添加0.2%的胆盐，则可以淘汰一部分不耐胆盐的菌株。在本试验中，分离乳酸菌是采用酸化胆盐mrs培养基(ph5.4，胆盐含量0.2%)，同时通过革兰氏染色和触酶实验获得3株乳酸菌。由于大部分具有优良的益生菌必须耐受消化道的低ph值，高胆盐等各种不利因素，才可能进入动物的肠道，定植于其特定部位发挥益生作用。实验获得的三株乳酸菌在ph3.0到9.0间均具有较强的耐受性，有利于在偏酸或偏碱的不同肠道位置中存活。鱼类的消化道含有多种消化酶，特别是蛋白酶，本实验研究了胰蛋白酶对3株乳酸菌的影响，结果显示3株乳酸菌对胰蛋白酶均具有较强的耐受性。同时乳酸菌在作为添加剂加入饲料的加工中，高温必然会影响菌体的活力。本实验的3株乳酸菌在50时，存活率很高，菌体浓度几乎没有变化，在70时处理10min仍有少量存活，在90处理2min后几乎存活率急剧下降。说明这3株乳酸菌对热有一定的耐受性，但处理温度不能高于90。综上所述本实验获得三株耐酸碱、抗胰蛋白酶及耐一定高温的乳酸菌。当然评价获得的益生乳酸菌，还需要很多后续实验。包括乳酸菌的肠道定植潜力，即益生菌在宿主中的生活力和抑制潜在致病性细菌的能力，可以通过考察候选益生菌对肠道粘液的粘附特性6,20。候选益生菌的体内实验，包括致病性的评估和对宿主免疫力的影响；同时益生菌的保护效果只有当环境恶化，容易爆发疾病时才会被观察到，所以对益生菌的效果评价还需要进行长期的试验观察才能确定。致谢本文是在导师王世锋教授的悉心指导下完成的，从实验设计到论文的定稿，每一个步骤都凝聚了王老师的智慧和心血。王老师严谨的作风、敏锐的思维、耐心细致的指导、谦和坦荡的为人让我受益匪浅。在此，我谨向为培育我而付出无数心血的导师致以我最诚挚的谢意！衷心感谢蔡妍、王珺老师提供实验器材和感谢她们在实验过程中的关心。同时也要感谢我的同窗好友陈书英，感谢他在实验期间给予我的帮助和支持。实验期间也得到了师姐刘巧红的指导，我的毕业论文才得以顺利完成！在此一并表示深深的感谢。参考文献1 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