香菇多糖的提取、纯化及组成分析 毕业论文.doc

香菇多糖的提取、纯化及组成分析 摘要：本实验通过热水提取，所得多糖用苯酚-硫酸法测定其含量，运用sevag法除蛋白，通过folin一酚法测定蛋白质含量，再用95乙醇沉淀，利用高效液相色谱法测定香菇多糖的单糖组分。结果发现香菇多糖的单糖组分主要有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖，其各单糖组分比例为man：rha：glu：gal=1.96：1.00：20.40：1.78。关键词: 香菇多糖；提取；纯化；组成分析extraction, purification and analysis of lentinan abstract： the present study refines water-soluble polysaccharide from lentinan by hot water extraction. determination of polysaccharide content by phenol sulfuric acid method. then removing protein by sevag method, determined protein by folin-phenol, precipitation by 95 ethanol,using gas chromatography analysis the monosaccharide. the results showed that lentinan monosaccharide composition contains: mannose，rhamose ，glucose ，galactose and rhanose with a molar ratio of 1.96：1.00：20.40：1.78.keywords：lentinan; extraction; purification； monosaccharide analysis前言近二十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切的关系多糖在医药上还是一种很好的佐剂。最近又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面，人们做了大量的工作。多糖是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是所有生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所需的多种生理功能有关。但就其研究状况而言，糖类尽管也取得了巨大的进展，但与蛋白质和核酸的飞跃式发展相比，显得远远落伍。对多糖的研究，最早是在20世纪40年代，其中研究得较早且最多的，是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗1。但多糖作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在20世纪60年代。尤其是近二十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能并且相继多次召开了有关“糖生物学和糖工程”的专题会议，1984年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了用全合成特定结构的荚膜多糖作疫苗，受到与会者的极大兴趣2。尔后，有关真菌多糖的研究为深入和广泛，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，报道数量较多。香菇又名香草、香信、冬菇、厚菇、花菇等。香菇是侧耳科的担子菌，世界名贵食用兼药用菌之一。香菇多糖是一种结构复杂的高分子化合物，具有多种生物活性，在生物体内起着重要作用。近年来，国内外学者对香菇多糖的药理作用做了大量研究，香菇中的多糖具有抗肿瘤、降血脂、抗血栓、抗菌、抗病毒等功效3。它含有多种有效药用组分，如香菇多糖、木质素等，而引起人们广泛地重视。全世界香菇集中分布在亚洲东南部国家和地区。我国香菇的分布比较广泛, 尤以东南部省区如福建、浙江、广东、广西、四川、云南等分布较多。香菇营养丰富, 滋味鲜美, 具有独特的色香味, 是世界上著名的食用菌之一。据分折, 每克干香菇中, 含有碳水化合物克, 蛋白质克, 脂肪克, 粗纤维克, 并含有一定数量的钙、磷、铁以及维生素等, 同时还含有多种酶和人体所必需的氨基酸, 营养价值很高4。我国是食用菌生产大国，其中香菇的产量在世界居首位。近年来，食用菌多糖的研究开发进入了一个崭新的发展时期，现在真菌多糖的研究主要针对香菇、金针菇、银耳、灵芝、蘑菇、黑木耳、茯苓和猴头菇等大型食用或药用真菌，这些真菌多糖具有通过活化巨噬细胞刺激抗体产生，提高人体免疫能力的生理功能，由于具备比从动物血液中提取的免疫球蛋白更大的实用性而日益受到重视，最具有代表性的是香菇多糖。香菇多糖的研究已成为一个热点，但目前主要集中在香菇中-(1-3)-d-葡聚糖的研究上，而其它多糖组分与生物活性之间的关系还有待进一步的明确。香菇多糖不仅是一种比较理想的药物，也是一类重要的保健食品功能因子，具有广阔的应用前景，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。在科学技术高度发达的21世纪，香菇多糖的研究必将有更广阔的发展前景，亟待人们去认识与开发。本文以香菇原料，通过水提法提取香菇多糖，对其进行脱蛋白，纯化并对其成分进行分析，以期为香菇的开发利用以及对香菇的深入研究和应用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂香菇：购自菜市场，烘干，粉碎后备用。葡萄糖，苯酚，浓硫酸，95%乙醇，无水乙醇，工业酒精，氯仿，正丁醇等，由指导师提供。1.2实验仪器紫外可见分光光度计（0600090n），t6新世纪， 北京普析通用有限公司shb-t循环水式多用真空泵， 郑州长城科工贸有限公司hws12型双列单孔电热恒温水浴锅， 上海-恒科技有限公司tdl-5-a型离心机shz-循环水式真空泵， 上海亚荣生化仪器厂电子天平 bs 223s 北京赛多利仪器有限公司电冰箱，bcd-208 华威电器公司冷冻真空干燥系统 cryodos-50waters 1525型高效液相色谱系统（1525高压泵和2487紫外检测器）柱子：c18色谱柱（1504.6 mm, 5 m）分液漏斗，布氏漏斗，抽滤瓶，烧杯（400ml，800ml，50ml，2000ml），索氏提取器，500ml烧瓶，容量瓶（500ml，50ml，1000ml，100ml）锥形瓶（250ml，50ml）等。1.3香菇多糖提取工艺流程图：香菇粉碎香菇粉末20倍工业酒精回流提取两次香菇残渣水浴浸提两次合并二次提取液用旋转蒸发仪浓缩至50毫升加3倍95%乙醇沉淀，放置过夜离心得到沉淀，获得粗多糖，加50毫升蒸馏水水溶用活性炭脱色，定容用sevag法脱蛋白，定容醇沉分别加入20毫升蒸馏水水溶冷冻，低温真空干燥，获得精多糖称量。具体实验过程1.3.1样品处理 将香菇置于万能粉碎机中粉碎，将样品粉末置于塑料袋中备用。1.3.2脱脂 称取25.0样品粉末，置于500锥形瓶中，加入500工业酒精，回流2，脱去表面脂肪。抽滤、重复次。1.3.3 水提 取脱脂后的样品在恒温水浴中热水浸提，水提的温度是80，料液比为1：20，时间为2小时。过滤后，滤渣在相同条件下重复浸提次。合并两次滤液。1.3.4浓缩 将合并液在真空旋转蒸发器中减压浓缩至50ml。（温度80，120rad/min，0.08）。1.3.5醇沉 在浓缩液中加入倍95乙醇，醇沉。放置过夜，离心，加50ml蒸馏水进行水溶。用紫外分光光度计，在波长490nm情况下测其od值。可以算出粗多糖提取率。1.3.6脱蛋白 粗多糖溶液经过sevag试剂（氯仿正丁醇41）除蛋白，先加入sevag试剂25ml，在500ml的锥形瓶中剧烈摇荡20min后静置，放出下层液，将上层液离心去除沉淀，取出上清液，将上清液再用此方法处理一次。1.3.7醇沉 在脱蛋白后的多糖溶液中加入倍95乙醇，沉淀用无水乙醇洗涤一次，离心，加20ml热蒸馏水复溶于50ml的小烧杯，测其od值。接着置于-20冰箱冷冻3-4小时，经冷冻干燥机干燥后得到粗多糖。1.3.8 称量 将干燥后的小烧杯在电子天平上称量，得到质量为m2，预先称量空烧杯质量为m1。即可获得多糖质量为m2-m1。1.3.9分子量测定 分别精密称取香菇多糖样品若干，溶于蒸馏水中。选择分子量范围与样品接近的葡聚糖标准品作标准工作曲线。实验条件：仪器：waters 1525型高效液相色谱系统（1525高压泵和2487紫外检测器）。色谱柱：c18色谱柱（1504.6 mm, 5 m），流动相：0.1 m ph 7.0磷酸盐缓冲液乙腈为82:18（v/v），流速为1.0 ml/min，进样量为10l，检测波长为245 nm。1.4 分析方法多糖含量的测定采用苯酚硫酸法。苯酚-硫酸法具有简单方便、显色稳定、灵敏度高、重现性好、不受蛋白质干扰，并且产生的颜色能够稳定160min以上等优点而深受欢迎。其原理是根据苯酚-硫酸试剂与游离的寡糖和多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）发生的显色反应。己糖在490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm处）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。具体操作见实验步骤。1.4.1葡萄糖标准曲线的制备5 标准葡萄糖溶液的配制:精确称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，加适量水溶解，转移至1000ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成浓度为100mg/l标准葡萄糖溶液，备用。6%苯酚试剂的配制:精确称取苯酚6g，加水94ml溶解，置棕色瓶放冰箱备用。标准曲线的绘制:精确量取葡萄糖标准溶液0.2ml，0.3ml， 0.4ml，0.5ml，0.6ml，0.7ml，0.8ml，分别补至1ml，再分别加入6%的苯酚溶液1ml，摇匀，然后加浓硫酸5ml，充分摇匀，室温放置30min，同时做一空白，在490nm处测定吸光度，再做一平行样.以浓度c对吸光度回归，得方程y=0.0121x-0.0054，r=0.9994，样品在080mg/ml的范围内线性良好.如表1表1标准曲线数据表table 1 standard of glucose date浓度（mg/l）020304050607080吸光度00.2380.3640.4670.5860.7130.8310.979图1葡萄糖标准曲线fig 1 standard curve of glucose1.4.2 香菇多糖提取率计算香菇多糖得率和纯度的测定。将冷冻干燥的样品适当稀释，取样品溶液0.1ml于试管中，然后加0.9ml蒸馏水补至1ml，按标准曲线制备步骤操作，测定样品的吸光度，由回归直线方程求出浓度c，然后由下式可求得香菇多糖的含量。多糖提取率6（%）= cvf10-4/m，其中c为苯酚-硫酸法所测吸光度根据标准曲线测得的多糖浓度，由回归直线方程求得的多糖浓度（mg/l），f为稀释倍数，v为母液体积，m为香菇粉干物质质量(mg)。1.4.3 folin一酚试剂法测定多糖中蛋白含量folin一酚试剂法7试剂甲:(a)称取10g na2co3、2gna0h和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至5ooml；(b)称取0.5gcuso45h2o，溶解后用蒸馏水定容至1ooml。每次使用前将(a)液50份与(b)液1份，即为试剂甲，当日内有效。试剂乙:folin&ciocalteus phenol reagent(sigma公司)标准曲线的绘制标准牛血清白蛋白溶液，浓度为296gml-1，取6支试管，依次加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，l.0ml；各管补蒸馏水至lml，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5ml，混合后在室温下放置10min，再各加0.5ml试剂乙，立即混合均匀。30min后，以蒸馏水为对照，于640nm波长下测定各管溶液的吸光度值。以牛血清白蛋白含量为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。表2 标准曲线数据表table 2 standard of glucose date浓度（mg/l）00.10.20.40.60.81吸光度00.0230.0530.1040.1590.2080.251y = 0.2557x + 0.0008r2 = 0.998700.050.10.150.20.250.300.20.40.60.811.2od值系列1线性 (系列1)图2蛋白质标准曲线fig 2 standard curve of protein1.4.4样品含量测定取样品lml，按标准曲线制作方法操作，比色测定。2 结果与分析2.1 粗多糖的得率在提取温度80，提取时间2h的实验条件下，得到多糖的含量，结果见表3。表3 糖提取率table 3 sugar extraction rate提取温度提取时间固液比糖含量802h1：201.024g从表3可以得到，在提取温度80，提取时间2h，固液比为1：20的实验条件下，提取的香菇多糖量为1.024g，所以粗多糖得率约为3.2。2.2 脱蛋白率 本次实验的目的是为了获得香菇多糖的单糖组分。因此为了减少香菇多糖中的蛋白质对本实验的干扰作用，用sevag法进行了20几次的脱蛋白，最终使香菇多糖中蛋白质的含量低于1。2.3 高效液相色谱法测定香菇多糖的分子量2.3.1 多糖的完全酸水解称取多糖样品5mg，加入2 m tfa（三氟乙酸） 0.5 ml，120水解2小时，然后移入蒸发皿，反复加无水乙醇，45水浴赶除tfa后干燥。2.3.2 单糖的pmp衍生化 向水解后得到的干燥单糖样品中加入0.5 m pmp和0.3 m naoh溶液各0.5 ml，样品充分溶解后取0.1 ml于1.5ml 离心管中，70 水浴反应30 min，离心（5000 rpm，5 min）后，加入0.3 m hcl 0.05 ml，充分混匀。加入1 ml氯仿，萃取剩多余的pmp试剂，离心（5000 rpm，5 min）弃去氯仿层，水层用0.22 m滤器过滤后，待用。精密称取香菇多糖样品若干，溶于蒸馏水中。选择分子量范围与样品接近的葡聚糖标准品作标准工作曲线。实验条件：仪器：waters 1525型高效液相色谱系统（1525高压泵和2487紫外检测器）。色谱柱：c18色谱柱（1504.6 mm, 5 m），流动相：0.1 m ph 7.0磷酸盐缓冲液乙腈为82:18（v/v），流速为1.0 ml/min，进样量为10 l，检测波长为245 nm。图3 标准单糖混合物图谱fig.3 gas chromatogram of aldononitrile acetate derivatives ofstandard monosaccharides图4 香菇多糖图谱fig.4 gas chromatogram of aldononitrile acetate derivatives of lentinusedodes标准单糖混合物、香菇多糖经高效液相色谱法的色谱图如图3、4所示。标准单糖混合物由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖及海藻糖9种单糖组成。而香菇多糖的主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖及半乳糖组成。其中以葡萄糖和半乳糖含量比较高，而甘露糖和鼠李糖含量比较少，这与谢红旗等人研究结果有一定的出入8。另外，香菇多糖图谱显示香菇多糖还含有一个未知的单糖(出峰时间在38min)，该峰的峰面积非常小，因此含量也比较低。根据峰面积计算出各单糖的相对百分含量，香菇的单糖组分比例为：man：rha：glu：gal=1.96：1.00：20.40：1.78（表2）。表4 多糖气相色谱分析结果table 4 the analysis results of lentinusedodes单糖种类保留时间（min）质量分数(%)mannose甘露糖13.8477.00rhamose鼠李糖17.3893.58glucose葡萄糖25.12773.02galactose半乳糖28.13616.393 总结本次实验的具体步骤可总结为：香菇粉碎香菇粉末20倍工业酒精回流提取两次香菇残渣水浴浸提两次合并二次提取液用旋转蒸发仪浓缩至50毫升加3倍95%乙醇沉淀，放置过夜离心得到沉淀，获得粗多糖，加50毫升蒸馏水水溶用活性炭脱色，定容用sevag法脱蛋白，定容醇沉分别加入20毫升蒸馏水水溶冷冻，低温真空干燥，获得粗多糖称量高效液相色谱法测定香菇多糖的分子量。植物类多糖的提取方法一般采用水溶液提取法、碱溶液提取法、酶解法、超滤法、超声波强化法、微波法等，多糖通常用水作溶剂来提取，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多糖多数都是中性多糖，用弱碱性水溶液可以提取含有糖醛酸的多糖，但应注意的是在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，提取时应尽量避免酸性条件。常规热水浸提香菇多糖的最佳工艺参数为：浸提温度80，浸提时间2小时，料液比为1:20，香菇多糖的提取得率为3.2。从菌类、植物中提取的多糖溶液，一般含有较深的颜色，色素的存在影响多糖的纯度和理论研究，因此要尽量去除。常用的脱色方法有过氧化氢9(氧化法)、活性炭法10和离子交换树脂法等，也有报道用大孔吸附树脂分离技术脱色11。多糖脱色是多糖纯化的一个关键工艺，对于颜色较深的多糖脱色仍然没有理想的方法。现有的方法主要采用活性炭吸附脱色，该方法脱色效果一般，活性炭对多糖的吸附严重。过氧化氢也用于多糖脱色，虽然脱色效果不错，但存在着多糖降解的问题，这很可能影响多糖的生物活性，因此使用其脱色要慎重考虑。离子交换树脂通常使用deae纤维素柱，由于deae纤维素价格昂贵，一般只能在理论研究中提取高纯度多糖使用，在工业化生产中不能得以应用。而在脱蛋白质方面，常用sevag法、三氯乙酸沉淀法和蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解法、鞣酸法等，也有人尝试使用盐酸法12对不同种类的多糖，采用不同方法，效果优劣亦有差异，如对红毛五加进行工艺比较研究得知：sevag法脱蛋白效果优于三氯乙酸法13，而对有的多糖，二者区别不大， 三氯乙酸法操作更为简便，而sevag法条件较为温和，其应用如鲍鱼多糖的脱蛋白14有时为达到更好的效果，也将几种方法联合使用15。由于蛋白类物质带有电荷，也有采用絮凝剂吸附除去16。不过采用sevag法，缺点是一次只能除去少量蛋白质，一般需要反复多次才能将蛋白质除尽，同时溶剂使用氯仿，氯仿易挥发，对人体有危害，污染坏境，并且要消耗大量的氯仿和正丁醇，造成生产成本过高，多糖也因多次除蛋白操作而损失严重。而三氟三氯乙烷法脱蛋白的效率较高，但也因其易挥发，不宜大量使用17。本实验通过高效液相色谱法测定香菇多糖的单糖组分，以0.1 m ph 7.0磷酸盐缓冲液为流动相，流速为1.0 ml/min，进样量为10 l，检测波长为245 nm，测定香菇多糖的组分。结果发现香菇多糖的单糖组分主要有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖，其摩尔比为man：rha：glu：gal=1.96：1.00：20.40：1.78。4 展望多糖与蛋白质和核酸相比，结构复杂得多，糖复杂的结构使其携带了大量的信息，多糖广泛存在于生命体中，参与了生命的几乎全部过程，因而了解多糖结构与功能关系是多糖研究的核心问题，也是揭开多糖神秘面纱的关键步骤18。近几十年来，大量研究表明，多糖具有多种生物活性:抗肿瘤，抗病毒，免疫调节功能，抗凝血，抗氧化，降血糖血脂，抗衰老，消炎、抗辐射和抗呕吐等功能19。之所以具有这些功能，这与它们具有独特的结构是密不可分的。如能从多糖的结构出发，解释结构与生物活性之间的必然联系，对增进对多糖的认识、开发出具有高效的多糖药物具有深远的意义。然而到目前为止，尽管科学工作者们对多糖进行了大量卓有成效的研究，但对于多糖的构效关系还不是非常明朗，很多结论都是根据分析和猜测，并且对多糖的构效关系的解释出现了许多不同的论述，没有形成一个有规律和总结性的科学结论20。而对于真菌多糖而言，原料的生长环境和培养条件以及提取分离工艺都会造成多糖结构上的差异，进而影响其活性。对多糖结构的充分认识有助于人们了解多糖、改造多糖，从而提高其生物活性。多糖的构效关系和作用机理仍需深入研究。致谢：感谢教授在百忙中给予的指导与更正，感谢老师的热心帮助。在整个实验的进行过程中，还要感谢老师对我的热心帮助。最后还得谢谢我的同学们，在实验室里有他们的帮助，使我的实验能得以顺利的进行，如期的完成。参考文献1谭周进,谢达平.多糖的研究进展.食品科技，2002，（3）:10-12.2wong c k, leung k n, ect. immunomodulatory and antitumor polysoccharides from edicinal j.j int med. res, 1994,22( 6) :299.3孟庆虹，张守文. 真菌多糖的研究进展j. 粮食与食品工业，2003，(3):42.4方积年.多糖体的结构分析.国外医学一药学分册，1981，8(4):222一228