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RTPCR TPCR - RT-PCR简介 反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-P CR）是将 RNA的反转录（reverse transcription ）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相 结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成 cDNA，再以 cDNA为模板，扩增合成目的 片段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA病毒 的含量和直接克隆 特定基因的 cDNA序列。作为模板的 RNA可以是总 RNA、mRNA 或体外转 录的 RNA产物。无论使用何种 RNA，关键是确保 RNA中无 RNA酶和基因组 DNA 的污染。 RTPCR - 原理 只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用 Olig o（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA为模板经行 PCR扩增，而获得 目的基因或检测基因表达。 RTPCR - 过程 RT-PCR 可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法 RT-PCR中，每一步都在最佳条 件下进行。cDNA 的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出 1/10的反应产物进行 PCR。 在一步法 RT-PCR中，在同时为反转录和 PCR优化的条件下，反转录和 PCR在一直观众顺次 进行。 1、反转录酶的选择 两种方法 1、Money 鼠白血病病毒反转录酶 有较强的聚合酶活性，RNA 酶 H活性相对较弱。最适作用温度为 37。 2、AMV 反转录酶 有强的聚合酶活性和 RNA酶 H活性。最适温度为 42。 2、合成 cDNA引物的选择 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中 的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞 mRNA，三种都可。 一步法 RT-PCR 引物的选择： 1. 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR反应。 两步法 2. Oligo dT 适用于具有 PolyA尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA不具有 PolyA尾巴。）由于 Oligo dT要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA样 品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长 cDNA合成量大大减少。 3. 基因特异性引物 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 RTPCR - 影响因素 RT-PCR 反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。 1、建议选择 0.5-3.0 mM (相差 0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。 2、对于具有较高 Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利 于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。 3、大多数目标 RNA经 40轮 PCR反应就能观察到。但如果目标 RNA太稀少，或者只有 很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到 45-50次。 反向 PCR 反向 PCR 反向 PCR 是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的 DNA，也就是说这 一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成 DNA。 反向 PCR - 简介 PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向 PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列 未知的基因片段不扩增。 反转录 PCR 反转录 PCR 又称为逆转录 PCR，是指扩增 mRNA 的一种实验技术。先将 mRNA 反转 录成 cDNA，然后再以 cDNA 为模板，用 PCR 方法加以扩增。 RT-PCR反应原理 反转录 PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转 录 PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用 Oligo(dT)或 随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA为模板进行 PCR扩增，而获得目的基因 或检测基因表达。RT-PCR 使 RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA样 品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA探针、 构建 RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录 PCR，是将 RNA的逆转录（RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增反应 （PCR）相结合的技术。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达 水平，细胞中 RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列等。 反转录 PCR - 一、反转录酶的选择 1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H活性相对 较弱。最适作用温度为 37。 2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA酶 H活性。最适作 用温度为 42。 3Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在 M n2 存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA模板的二级结构。 4MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript。此 种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反 转录很困难的 mRNA模板合成较长 cDNA。 反转录 PCR - 二、合成 cDNA引物的选择 1 随机六聚体引物：当特定 mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系 中所有 RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性 。通常用此引物合成的 cDNA中 96%来源于 rRNA。 2 Oligo(dT)：是一种对 mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA具有 3端 Po ly(A )尾，此引物与其配对，仅 mRNA可被转录。由于 Poly(A )RNA仅占总 RNA的 1-4%， 故此种引物合成的 cDNA比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA在数量和复杂性方面均要小 。 3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物 ，若 PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR扩增。 反转录 PCR - 三、操作步骤 1. 总 RNA的提取。 2. cDNA 第一链的合成（Reverse Transcription）：目前试剂公司有多种 cDNA第一 链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL公司提供的 SuperScrip tTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 （1）在 0.5ml微量离心管中，加入总 RNA 1-5g，补充适量的 DEPC H2O使总体积达 11l。在管中加 10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。 （2）70加热 10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10PCR buffer 2l 25mM MgCl2 2l 10mM dNTPmix 1l 0.1M DTT 2l 轻轻混匀，离心。42孵育 2-5min。 （3）加入 Superscript1l ，在 42水浴中孵育 50min。 （4）于 70加热 15min以终止反应。 （5）将管插入冰中，加入 RNase H 1l ，37孵育 20min，降解残留的 RNA。-20 保存备用。 3PCR： （1）取 0.5ml PCR管，依次加入下列试剂： 第一链 cDNA 2l 上游引物（10pM） 2l 下游引物（10pM） 2l dNTP(2mM) 4l 10PCR buffer 5l Taq 酶（2u/l） 1l （2） 加入适量的 ddH2O，使总体积达 50l。轻轻混匀，离心。 （3） 设定 PCR程序。在适当的温度参数下扩增 28-32个循环。为了保证实验结果的 可靠与准确，可在 PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩 增内参 DNA，作为对照。 （4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。 反转录 PCR - 四、注意事项 1 在实验过程中要防止 RNA的降解，保持 RNA的完整性。在总 RNA的提取过程中， 注意避免 mRNA的断裂。 2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3 内参的设定：主要为了用于靶 RNA的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸 脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA定量误差、加样误差以及各 PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4 PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结 构以及目标 DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通 过单独实验来确定。 5 防止 DNA的污染： （1） 采用 DNA酶处理 RNA样品。 （2） 在可能的情况下，将 PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA的共 线性。 巢式 PCR 巢式 PCR 是一种变异的聚合酶链反应(PCR) ，使用两对（而非一对）PCR 引物扩增完整 的片段。第一对 PCR 引物扩增片段和普通 PCR 相似。第二对引物称为巢式引物（因为他 们在第一次 PCR 扩增片段的内部）结合在第一次 PCR 产物内部，使得第二次 PCR 扩增 片段短于第一次扩增。巢式 PCR 的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二 次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式 PCR 的扩增非常特异。 巢式 PCR - 定义 巢式 PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR 引物扩增完整的片 段。第一对 PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第 一次 PCR扩增片段的内部）结合在第一次 PCR产物内部，使得第二次 PCR扩增片段短于第 一次扩增。巢式 PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片 段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式 PCR的扩增非常特异。 巢式 PCR - 原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA在多种酶的作用下可以变性解 链成单链，在 DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子 挎贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为 双链。因此，通过温度变化控制 DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入 DNA聚合 酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA 聚合酶在高温时会失活，因此，每 次循环都得加入新的 DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了 PCR技术的应用 和发展。 发现耐热 DNA聚合同酶-Taq 酶对于 PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受 90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使 PCR技术变得非常简捷、同时也大大 降低了成本，PCR 技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR 技术的基本原理 类似于 D NA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至 9 3左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加 热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；引物 的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又 可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩 增放大几百万倍。 巢式 PCR - 反应 巢式 PCR通过两轮 PCR反应，使用两套引物扩增特异性的 DNA片断。第二对引物的功能是 特异性的扩增位于首轮 PCR产物内的一段 DNA片断。 第一轮扩增中，外引物用以产生扩增 产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。从而提高反应的特异性。 巢式 PCR - 实验步骤 第一步：目标的 DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似 结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种 产物）。 第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮 PCR扩增的产物进行第二轮 PCR扩增。 由于第二套引物位于第一轮 PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性 极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式 PCR扩增确保第二轮 PCR产物几 乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。 巢式 PCR - 应用 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。在 RACE(rapid-amplif ication of cDNA ends)中，也利用巢式 PCR增加特异性。 巢式 PCR，可以在 10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次 PCR 容易产生成片的产物，是效果最好的 PCR，但也因此是最容易污染的 PCR。 1 巢式 PCR - 巢式 PCR相对普通 PCR的优缺点 优点 1、克服了单次扩增“平台期效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了 PCR的敏 感性； 2、由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特 异性； 3、内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段 反应正确性的鉴定，因引可以保证整个反应的准确性及可行性。 缺点 进行第二次 PCR坟增引起交叉污染的几率大。为了克服此缺点，可彩用同一反应管中巢式 PCR，主要利用内外引物 Tm值不同。 如果你已排除引物，酶，RNA 提取，逆转录等等其他原因引起的 PCR不成功，确定关键原 因是模板量低的话，可以用巢式。但还是建议先排除一下其他可能因素，毕竟普通 PCR简 单。 荧光定量 PCR 荧光定量 PCR - 概述 荧光定量 PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧 光标记的特异性的探针，对 PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的 软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 荧光定量 PCR - 原理 PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸 ，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在 DNA任意一条单链上;PCR 扩增时，Taq 酶 的 5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而 荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了 荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。 荧光量化 PCR原理 荧光定量 PCR - 应用领域 TL988 型 实时荧光定量 PCR仪应用领域 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中 海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志 物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。 动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放 线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业 及乳品 多重 PCR 多重 PCR 所属现代词，指的是一般 PCR 仅应用一对引物，通过 PCR 扩增产生一个核酸 片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。 多重 PCR - 简介 一般 PCR 仅应用一对引物，通过 PCR 扩增产生一个核酸片段 ，主要用于单一致病因子等 的鉴定.多重 PCR(multiplex PCR)，又称多重引物 PCR 或复合 PCR，它是在同一 PCR 反应 体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的 PCR 反应，其反应原理，反应试剂 和操作过程与一般 PCR 相同 . 多重 PCR 的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基 因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一 PCR 反应管中同时加上多种 病原微生物的特异性引物，进行 PCR 扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型 病原体感染， ，可系统组合的有:肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时 存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重 叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠 .肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有 较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.性病的检测，如梅毒，淋病及 艾滋病的诊断.战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆 菌，鼠疫杆菌等侦检.需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌