药物分析中的新技术新方法ppt课件

药物质量控制中现代药物质量控制中现代 分析中的技术与方法分析中的技术与方法 1 手性分离色谱 2 一、手性药物的现状 手性药物（ 579） 药物（ 1992） 天然和半 合成药物 （ 556） 合成药物 （ 1436） 非手性药物 （ 857） 单一异构体 （ 73） 外消旋体 （ 506） 手性药物（ 547） 非手性药物 （ 9） 单一异构体 （ 537） 外消旋体 （ 10） 3 二、手 性 药物对映体的药效学差异 1. 治疗作用完全依赖一种异构体 如： S(-)- -甲基多巴 2. 药理作用差别不大 如：异丙嗪 3. 药理作用类似，但反应强度有差别 4. 药理与毒理作用存在 “ 质 ” 的区别 4 二、手 性 药物对映体的药动学差异 1. 吸收 2. 蛋白结合 3. 代谢 5 1. 间接法拆分对映异构体即衍 生化试剂法（ CDR） 2. 直接法拆分对映异构体 手 性 固定相法（ CSP） 手 性 流动相添加剂法（ CMP） 三、手性药物拆分的高效液相色谱 法分类 采用非手性固定相 6 四、拆分原理： 为了使对映体转化为化学和物理 性质不同的非对映体，就要提供一种 手性源 （ CDR ） ，使待拆分的对映 异构体（样品）、手性作用物（如固 定相）和手性源之间形成一个非对映 异构分子的络合物。 三点手性识别模式 7 (R) SE+ (R) SA ( R) SE ( R) SA (S) SA ( R) SE ( S) SA 1. CDR 8 柱前手性衍生化法：对映体混 合物以手性试剂作柱前衍生化，形 成非对映体，然后以常规（偶见手 性）固定相分离。 对手性衍生化试剂的要求：高 光学纯度。 常用的手性衍生化试剂：羧酸 衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、 异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活 性氨基酸类、固相衍生化试剂。 9 10 l 手性衍生化特点： 1. 需要高光学纯度的手性衍生 化试剂； 2. 反应繁琐费时； 3. 衍生化反应速率重现性较差 4. 只需使用价格便宜、柱效较 高的非手性柱 5. 衍生化过程可同时纯化样品 11 柱前衍生化 -反相高效液相色谱法 拆分酮洛芬对映异构体 S-()-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬 12 酮洛芬对映体的柱前 衍生化示意图 13 酮洛芬对映体的柱前 衍生化方法 酮洛芬 对照 品溶液 (1 mg/mL)0.1 mL 加入正己烷 0.6 mL 二 氯亚砜溶液 0.2 mL 75 1 h 冷却 至室 温 吹干后 加入 S- NEA溶液 0.2 mL 5 min 振摇 加入 2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL 混 匀 吹干后 溶解进样 二氯 甲烷 :乙醚 2:1 14 色谱条件 色谱柱： Hypersil C18, 5 m, 1505.0mm ID， 流动相：乙腈 水 -乙酸 -三乙胺 (55 : 45 : 0.1 : 0.02， v/v)， 流速 ： 1 ml/min, 检测波长： 254 nm 15 酮洛芬对映体 衍生化物色谱图 RS 酮洛芬对映体 衍生化物的保留时间为 tR=7.3 min， tR=8.5 min， 分离度为 1.9 16 2. CSP 利用手性固定相与对映体消旋 物相互作用，其中一个与手性固定 相生成不稳定的短暂的对映体复合 物，使两种异构体在色谱柱上的保 留时间不同，从而得到分离。 17 l 常用的手性固定相： 1. Pirkle型固定相 2. 合成多聚固定相 3. 环糊精键合固定相 18 特点 1.适用范围广 2.制备分离方便 3.定量分析的可靠性高 4.价格昂贵 19 奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（ A） 和苯丙氨酸（ B）的 p-溴代苯甲酰胺衍生 物对映体色谱图 20 3. CMP 将手性试剂添加到流动相中， 利用手性试剂与药物消旋物中各对 映体结合的稳定常数不同，以及药 物与结合物在固定相上分配的差异 ，实现对映体的分离。 21 l 常用的手性添加剂： 1. 配基交换型手性添加剂 2. 手性离子对络合剂 3. 环糊精添加剂 22 特点 1.可采用普通的非手性固定相 2.不需对样品进行衍生化 3.手性添加物的可变范围较宽 23 五、应用 1对某些手性药物进行对映体的 纯度检查； 2生物体液中药物对映体的分离 分析研究可探索血药浓度与临床疗 效的关系； 3在研制手性药物过程中，可分 别评价单个对映体的效价、毒性、 不良反应、药动学性质； 4必要时，可进行手性药物对映 体的制备分离（或拆分）。 24 高效毛细管电泳高效毛细管电泳 （ HPCE） 25 HPCE是经典电泳技术与现代微 柱分离相结合的一种快速、高效的 液相分离技术。具有以下特点： 1. 高效 2. 高速 3. 微量 4. 低消耗 26 高压电源 毛细管恒温系统 检测器 数据处理系统 毛细管 缓冲液 /样品 缓冲液 （ + ） ( ) 毛细管电泳装置示意图 27 （一）基本原理： v = veo+ vep = ( eo+ ep)E veo： 电渗流速度 eo： 电渗流淌度 vep： 电泳流速度 ep： 电泳流淌 度 E： 电场强度 28 + + + + + + + + + + + + + + + + + ( ) (+) 电渗的产生 29 ( ) (+) + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - 毛细电泳中不同组分的迁移示意图 30 （二）主要分离模式 1. 毛细管区带电泳（ CZE） 2. 胶束动电毛细管色谱（ MECC） 3. 毛细管凝胶电泳（ CGE） 4. 毛细管等电聚焦（ CIEF） 31 模式 缓冲液体系 分离机理 CZE 自由缓冲液 离子淌度 MECC 胶束缓冲 溶液 疏水性 /离子性 相互作用 CGE 凝胶缓冲 溶液 分子大小和 荷电数目 CIEF 两性电解质 等电点 32 毛细管区带电泳 最基本、最广泛的分离模式 。 适用于所有具有不同淌度的 荷电粒子的分离，但不能中性 物质及质荷比相同的组分。 33 2. 胶束动电毛细管色谱 用离子胶束溶液代替简单的 缓冲溶液，使中性组分可按其疏 水性的不同及在两相间的分配系 数的不同而分离。采用手性分配 相，可用于手性化合物的分离。 34 3. 毛细管凝胶电泳 凝胶的网络结构对溶质具 有分子筛的作用，可分离质荷 比相同但分子大小不同的组分 。 在分子生物学和蛋白质化 学上有着十分广泛的应用。 35 4. 毛细管等电聚焦 根据蛋白质的等电点不同 而进行分离。 A A A A A A B B B B B B C C C C DDDD D EE E E EF F AA AA BB BB CC CC DD DD EE EE FF FF pH梯度 高低 36 l 应用： 1. 监测药物生产过程 如：监测青霉素发酵液中有关 物质的量 37 青霉素发酵液的高效毛细管电泳图 1. 青霉素 G钠 ； 2. 6-APA ； 3. 对羟基苯乙酸 ； 4. 邻羟基苯乙酸 ； 5. 苯乙酸 38 2. 中药成分分析 如：黄酮及其甙类分析 39 黄芩中 6种黄酮类成分的 胶束电动毛细管色谱分离图 1.汉黄芩甙； 2. 黄芩素 ； 3.黄芩甙； 4. 千层子素 ； 5. 汉黄芩素； 6.内标水杨酸； 7.白杨素 40 3. 手性拆分 4. 体内分析 41 质谱法及其应用质谱法及其应用 进样系统 离子源 质量分析器 检测器控制和数据 处理系统 真空系统 42 一、离子源及离子化技术 1、 EI（ 电子轰击离子化） V 加速电压 试样蒸汽 阴极 阳极 电子束 离子 x y z 电子轰击质谱示意图 43 l 优点： 灵敏度高，有丰富的碎片离子信 息和成熟的离子开裂理论，是结构分 析、鉴定的有力手段；重现性好，有 标准图谱，可以通过谱库检索对未知 物进行结构鉴定。 l 缺点： 样品须汽化后才可离子化 l 适用化合物： 易挥发、热稳定化合物。 44 2、 CI（ 化学离子化） 软电离技术 l 优点： 可以得到较强的准分子离子峰， 有利于分子量的测定 l 缺点： 样品须汽化后才可离子化 l 适用化合物： 易挥发、热稳定化合物 45 3、 FAB（ 快原子轰击离子化） 软电离技 术 l 优点： 样品不须汽化；既给出化合物 的分子量信息，又给出结构信息。 适用范围广，仪器商品化较早，普 及率高。 l 缺点： 重现性差，灵敏度较 EI低。 l 适用化合物： 极性、高分子量、非挥发性及热不稳 定化合物。 46 + + + + + 快原子枪 样品靶 原子束 质量分析器 二次离子束 快原子轰击质谱示意图 47 4、 MALDI（ 基质辅助激光解吸离子化 ） 软电离技术 l 优点： 通常只给出分子离子峰（或准分 子离子峰）。 l 适用化合物： 蛋白质、多肽、寡核苷酸等生 物大分子 48 5、 API（ 大气压离子化） 软电离技术 （ 1） ESI（ 电喷雾离子化） l 特点： 能够产生多电荷离子。 l 适用化合物： 对生物大分子及其他分子量 大的化合物的分析较有利。 49 + + + + + + + + + + 毛细管 + 4kV 含离子的液滴 随液滴蒸发， 电场加强，离 子向表面移动 离子从表面蒸发 离子蒸发机理 50 （ 2） APCI（ 大气压化学离子化） 最软的电离方式之一 l 特点： 一般只给出化合物的分子量 信息，通过源内 CID（ 碰撞诱导分 解）可同时获得结构信息。 l 适用化合物： 与 ESI比较，更适于分析极性 及分子量小（ 1000 amu） 的化合 物。 51 反应气等 离子体 Corona 放电 电极 真空 样品 + 溶剂 雾化气 加热管 APCI电离原理 52 二、质量分析器及质量分离原理 1、 扇型磁场质谱仪 2、四极质谱仪 3、飞行时间质谱仪 4、离子阱质谱仪 53 核磁共振光谱分析法 核磁共振光谱广泛用于化合 物的结构分析，而其在化合物的 定量分析中的应用则是比较新的 内容，日益受到重视。 54 1定量参数：峰面积或峰高。 2定量的特点： 1）对于确定的核（质子），其信号 强度与产生该信号的核（质子）的 数目成正比，而与核的化学性质无 关。 2）利用内标法或相对比较法分析混 合物中某一化合物时，物需该化合 物的纯品作为对照标准。 55 3）峰很窄，远小于各化合物之间的 化学位移的差值，因而混合物中不 同组分的信号之间很少发生明显的 重叠。 4）方法简单快速、准确、专属性高 ，不破坏被测样品，可选择性的测 定混合药物或药物制剂中的组分乃 至药物的立体异构体。 56 3测定方法：选择一个合适的峰作为测 量峰。 （ 1）内标法（绝对测量法） 内标法为 NMR定量分析最常用的方法，它与 GC的内 标法相似，在样品溶液中，直接加入一定 量内标物质后， NMR光谱测定，将样品指 定基团上的质子引起的共振峰面积进行比 较，当样品与内标均经精密称重时，则样 品的绝对重量（ Wu）可由下式求得： 57 Wu Au Eu Au