固相萃取与超高效液相色谱联用测定沼液中的四种植物激素

固相萃取与 UPLC 联用测定沼液中的四种植物激素 文先红 1 宋成芳 2 张妙仙 2 单胜道 2 1（浙江农林大学理学院，临安 311300） 2（浙江农林大学环境科技学院，临安 311300） 摘要：沼液中含有丰富的有机酸，植物激素等有机质，因而被广泛用作植物生长促进 剂。本实验建立了一套可靠的在沼液中提取，纯化和测定四种重要的植物激素 (GA3,IAA,ABA and ZT)的方法。经过液液萃取后，通过 SPE 固相萃取纯化和浓缩样品, 进入 ACQUITY UPLC BEH C18 colum (2.1mm x 50mm ,1.7m )进行色谱分离, 流动相采用 甲醇和 0.1%的甲酸水溶液（ pH=3.2） ，流速 0.22ml/min, 进行梯度洗脱，PDA 检测。实验 中对影响色谱分离的几种重要因素进行了讨论，样品中四种激素的回收率可达 91.3% 到 101.2%，结果证明 SPE-UPLC 方法能对沼液中的四种激素进行高效率的分离，测定。 关键词： 沼液，激素，超高液相色谱，固相萃取 1 引言 沼液是沼气厌氧发酵后的产物, 含有丰富的氮、磷、钾等营养元素，还含有蛋白质， 有机酸和多种植物激素，其速效营养能力强, 成分可利用率高 , 而且具有防病抗逆作用, 是 一种优质的具有生物肥料和生物农药双重功效液体肥料，特别其提取物可用作促进植物花 果生长的叶面肥。植物激素中的细胞分裂素(ZT)能促进细胞分裂 , 对种子和芽有促使萌发 的作用, 含有的 3-吲哚乙酸(IAA)能促进种子发芽, 提高发芽率，赤霉素(GA)可以刺激农作 物茎、叶快速生长, 而脱落酸(ABA)则具有抑制生长、促进衰老的作用。因而作为叶面肥使 用的沼液必须测定其中这四种重要的植物激素含量。 近几十年来, GC 法,GC-MS 法及电分析法, 液相色谱法(HPLC)，液质连用(LC-MS )等被广泛地应用于植物激素的分离和定量测定。其中高效液相色谱是植物内源激素分析的 有效手段, 但在同时测定植物组织提取液中的多种内源激素时, 经常出现到分离度差、存在 干扰峰及严重拖尾现象。超高效液相色谱采用 1. 7 m 颗粒度的色谱柱填料 ,能获得更高的 柱效 ,并且在更宽的线性范围内保持柱效恒定; 超高效液相色谱的峰容量、分析效率、灵敏 度较常规高效液相色谱有了很大的提高。在提取方法上，与液液萃取法相比, 固相萃取对 分析物有更高回收率;更有效地将分析物与干扰物质分离。本研究旨在建立对沼液中植物内 源激素的有效提取方法, 并探讨利用 UPLC 法同时测定玉米素 ZT 、赤霉素 GA3、3- 吲哚 乙酸 IAA 和脱落酸 ABA 四种激素的色谱分析条件。 2. 实验部分 2.1 仪器与试剂 ACQUITY Ultra Performance LC 超高效液相色谱仪 Waters 公司，Sep - Pak C18 （500 mg, 3 mL, Waters 公司） ，标样 ZT ，GA ，IAA，ABA 为 SIGMA 公司产品; 甲醇、三乙 胺、甲酸纯度为色谱纯(德国 Sigma-Aldrich 公司), 盐酸, 乙酸乙酯, 石油醚为分析纯。 分别称取标准品各 10. 00mg, 用甲醇溶解后转移至 10mL 棕色容量瓶中, 用甲醇定容 ,于 4 条件下保存。根据需要, 用甲醇稀释上述标准储备溶液 , 配制成不同浓度的标准工作 液。 2. 2 色谱条件 色谱条件: BEH C18 柱（2.1mm x 50mm ，1.7m）; 流动相为 A 为甲酸水溶液 （w/v,0.1%, 甲酸先用三乙胺（TEA）调节 pH=3.2.）, B 为甲醇, 流速 0.22ml/min。流动相 梯度设置: 0 3 min, 90% A; 36 min, 9070% A; 6 10 min, 70% A; 1016 min, 70% 55% A; 1618min, 55% A;1818.1min, 5% A; 18.120.1 min, 5% A; 20.2min, 90% A。检 测: DAD ，200-450nm 。进样量 : 10 L; 柱温: 25 。 2.3 样品前处理 从沼液池中取出的液体过滤浓缩 20 倍得到沼液 50ml, 加入 50 mL 80% 冷甲醇，4 冷浸提取 24 h ; 于 4 5 000 r/ min 离心 10 min , 重复 3 次, 残渣用少许 80 %甲醇洗 3 次, 合并全部洗涤液和浸提液, 用等体积石油醚萃取脱色 3 次 , 其水相用 1 mol/ L 盐酸调 pH 至 2. 5 , 用等体积乙酸乙酯萃取 3 次, 弃去水相; 合并乙酸乙酯相在于 3540 下减压蒸 发至 10ml 后， 用真空干燥箱干燥 , 再用 10ml 10%的甲醇溶解，再过 Sep - Pak C18 小柱 （放入样品前，先用 5ml 的 methano 净化，再用 5ml 去离子水活化, 放入试液后, 用去离 子水 5ml 先淋洗，再用 5ml 80%的甲醇洗脱） 收集后, 再经超滤膜过滤 , 作为供试液。 3. 结果与讨论 3.1 pH 对沼液中激素提取效果的影响 由于植物内源激素本身是偏酸性的物质，为了得到最大乙酸乙酯萃取效率，实 验了不同的酸性 pH=2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 对萃取的影响，实验过程中萃取时间为 30min，室 温 250c 遮光进行以防止吲哚乙酸的分解。结果显示酸性越强萃取效果越好，故实验中用盐 酸把 pH 调节到 2.5 进行萃取。 3.2 色谱条件的优化选择 实验采用甲醇和甲酸水溶液作为流动相，由于这几种植物内源激素偏弱酸性，重 点考察了 pH 的变化对分离效果的影响。当 pH 在 3.2, 3.4, 3.8, 4.2, 4.6 之间变化时，发现 pH 高于 3.2 时随着 pH 的增大组分的保留时间变长，且峰形变钝有拖尾现象，在酸性较高 时峰形有明显改善，减少了拖尾程度，可能由于抑制了其它杂质离子与组分之间的竞争平 衡及一些不可逆化学吸附从而使峰的形状得到了改善，最后采用 pH 为 3.2。 相对于固定洗脱，采用梯度洗脱法能延缓出峰时间以避开部分杂质峰干扰, 从而达到 较好的分离效果，特别是其中赤霉素 GA 与吲哚乙酸 IAA 组分的保留特性相似，容易发生 峰的干扰，采用上述梯度洗脱程序可在 15min 之内将这些组分完全分离，不仅可以大大加 快分析速度而且峰形也好，定量分析结果准确。 在流速的选择上，当速度增加时，扩散加剧，组分保留时间缩短，但峰重叠程度增加， GA 与 IAA 之间的出现部分重叠拖尾现象，考虑到实际样品含有有机物成分多，为防止重 叠故实验选择较低流速 0.22ml/min。 有机酸在水溶液中存在离解平衡，温度升高时会增加溶质的离解, 离子受 DONNAN 作用, 虽然保留时间减少, 但不利于有机酸的分离 ; 激素中 GA, ABA, IAA 都含有羧酸基 团，当温度超过 25时各有机酸分离效果较差。因此, 本实验选择柱温 25。 3. 3 方法线性范围、检出限、精密度 将 ZT ，GA ，IAA，ABA 等四种激素标准样品储备液按一定比例稀释, 用优化后的 色谱方法进行分析测定, 得到相应的峰面积 , 进行线性回归处理。它们的峰面积和质量浓 度 mg/L 的相关系数都在 0. 99910. 9997 之间,说明在设定的浓度范围内线性关系良好; 样品平行测定 5 次,考察方法精密度; 通过分析稀释后的标准品储备液 , 以 3 倍信噪比 S /N 计算检出限。色谱图和结果见图 1 和表 1。 图 1. 标样的色谱图(四个色谱峰从左到右分别对应的激素是 ZT,GA, IAA, ABA)。 表 1 回归分析、精密度、检出限 Table 1Regression analysis, RSD and detection limit 激素 线性范围 回归方程 相关系数 精密度 检出限 Phytohormones Linear range Regression equations Correlation Precision Detection limit (mg/L) coefficien RSD (%) (g/l) Zt 0.1100 Y = 6E+10X- 271024 0.9997 0.53 1.5 GA 0.2 100 Y = 5E+09X 84718 0.9991 0.71 5.9 IAA 0.1100 Y= 5E+10X 542536 0.9993 0.57 2.2 ABA 0.1100 Y = 4E+10X 251293 0.9996 0.32 1.1 3.4 沼液中激素的色谱分析 用上述实验方法提取, 分离处理得到的沼液进行 UPLC 测定，图 1 和图 2 显示了标准 品和样品的色谱图，从图中可以看出，在标样的保留时间 14.18min 对应的 ABA 在样品中 没有发现，而在 8.01min 对应的峰很高，通过回归方程计算并除以提取过程中的浓缩倍数 得到 GA 含量为 6.02g/ml, 而 5.43min 对应的 Zt 含量为 0.25g/ml, 8.9min 对应的 IAA 含量 为 0.34g/ml. 实验表明含量最高的是赤霉素 GA, 而抑制生长、促进衰老的作用的脱落酸 ABA 基本不含有。在沼液中加入 4 种激素的标样，其加标回收率为 91.3% 101.2%，见表 2。 图 2. 沼液提取物的色谱图. 表 2. 样品测定结果及回收率 激素 含量(g/ml) 加入量 (g/ml) 测得量 回收率 ZT 0.25 0.21 0.42 91.3% GA 5.02 3.00 8.12 101.2% IAA 0.34 0.32 0.62 93.9% ABA - 0.35 0.33 94.3% 上述结果表明, 本实验方法具有处理简单、分离度好、分析速度快等优点, 适用于沼液 中的四种主要植物激素的同时快速检测。 Simultaneous determination of four phytohormones in Biogas slurry by solid-phase extraction and UPLC Biogas slurry, which contain rich organic matter, such as organic acid and some phytohormones, is extensively used as a growth promoting supplement for plant . In this paper, an reliable method of extraction, purification and determination to four phytohormones (GA3,IAA,ABA and ZT ) in biogas slurry has been developed. Accompanied with liquid phase extraction, the solid- phase extraction technology was applied to concentrate and purify the the biogas slurry, the separation was carried out on a ACQUITY UPLC BEH C18 colum (2.1mm x 50mm ,1.7m ) using gradient elution with methanol/water containing 0.1% Formic acid (pH=3.2) as the mobile phase at the flow-rate of 0.22mL/min, and PDA detection. The effects of several UPLC parameters on the resolution were studied systematically. Good recoveries from 91.3% t o 101.2% for the four phytohormo