发酵法生产紫杉醇的工艺研究

发酵法生产紫杉醇的工艺研究 (孙春艳 S2009134 ) 一、 项目立项依据（立项的必要性及需求分析） 紫杉醇(paclitaxel，商品名 Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢 物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。由于其具有显著抗 癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅 速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在 G2 期和 M 期， 直至死亡。2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素 (IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2 对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。 紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。在癌症方面， 对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。在非 癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑 制作用。 随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发 生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。 紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐 1000-2000棵树的树皮。 据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算， 每年要收集700吨树皮来提取。即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森 林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否 成功走向市场的的关键。但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无 法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。 发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是 值得研究应用的。 针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价 格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。 二、 项目目标及主要任务 抗癌新秀紫杉醇自投放市场后，其市场销售额每年以两位数增长并高居抗肿瘤药之首， 1996 年紫杉醇的全球销售额已达 8 亿美元（其中美国本土为 5 亿美元） 。1998 已超过 12 亿 美元/ 年。合成的紫杉醇销售额大约在 9000 万美元。目前已有 50 多个国家已批准销售合成紫 杉醇。据美国国家癌症研究所（NCI ）预测，在今后 10-15 年内紫杉醇将成为抗癌首选药物 之一，经济效益可观。 本项目的目标及任务是利用发酵方法大量的生产紫杉醇，同时把科技成果推广开来。 三、 国内外现状、发展趋势及工作基础 紫杉醇最早是Wani等于1971年从短枝红豆杉(Taxusbreviifolia) 树皮中分离得到的。随后， Schiff 等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。 由于红豆杉系珍稀植物，而树皮中的紫杉醇含量很低，靠树皮提取紫杉醇不能满足需求， 并且严重地破坏自然资源，危及生态平衡。为了解决药源紧缺状况，长期以来科学家们为解 决这一巨大供求矛盾做出了很大的努力，包括筛选高产红豆杉栽培品种、化学合成、基因工 程、细胞培养、真菌发酵、寻找紫杉醇类似物等，其中对紫杉醇生源途径的研究处于核心地 位。 目前紫杉醇的药源途径主要有：（1）植株栽培法即通过杂交的方法：获得生长周期短、 紫杉醇含量高的红豆杉新品种，并与直接提取法相结合来分离提取紫杉醇，国内外都建立了 红豆杉种植园，紫杉醇的含量也不低于野生植株，取得了一定的成效。但受土壤、气侯、季 节等的影响，难以大面积堆广。（2）全合成法：紫杉醇结构复杂，母核有9个手性中心，侧 链有2个手性中心，因此应有2048个非对映异构体，它的合成过程复杂，虽然Nincolaou等于 1994运用逆合成分析法的战略全合成了紫杉醇，但是需要有2225步，难度较大，要真正用 于工业生产紫杉醇还有一定的距离。（3）半合成法：利用在植物中含量较大的紫杉醇杉醇 前体物化学转化成紫杉醇。1988年Dents从欧洲红豆杉的针叶中得到含量为0.1% 的紫杉醇前体 化合物：l0-去乙酰白卡亭- ，以此为原料半合成了紫杉醇以及同系物taxotere ，后者的优点 在于有效好的水溶性(从而提高了生物利用度且给药时间大为缩短) ，也有广泛的体外抗癌活 性。机理与紫杉醇类似。针叶资源丰富，再生能力强，半合成工艺实验室己趋于成熟，因此 半合成被认为是扩大紫衫醇来源的有效途径，这是目前市场上紫杉醇类物质的主要来源。但 这种方法仍然摆脱不了对红豆杉树木原料的依赖。（4）真菌培养法：从红豆杉的树皮中分 离出能产生紫杉醇的内生真菌，由于真菌生长速度快，来源广，菌种选育简单，可通过发酵 大规模生产。因此通过真菌发酵生产紫杉醇的前景是十分可观的。目前，真菌培养液中只能 获得纳克培养，离产业化生产还很远13。（5）细胞培养：根据细胞全能化的观点，通过细 胞培养方式可大量生产紫杉醇。细胞培养方式速度快，培养条件易于优化，培养过程易于人 工控制，不受时间、地域等因素的限制。紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约， 短期内难以突破。 最早Stierle 和Strobel 等在短叶红豆杉 ( T. brevifolia)的枝条上分离到一种内生真菌，能够 产生紫杉醇，定名为安德列亚霉( Taxomyces andreanae)。当时这一发现对紫杉醇药源开发是 一个重大的突破，为开发紫杉醇来源提供了一条新的途径。此后，各国学者纷纷开展产紫杉 醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国 红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。在红豆杉以 外的树种中，研究人员也分离到了可产紫杉醇的内生真菌。Li 等从秃柏( Taxodium distichum) 的树皮、韧皮部和木质部中都分离到产紫杉醇的内生真菌Pestalotiopsis microspora 。Strobel GA等从一种松树(Wollemia nobilis) 分离到产紫杉醇内生真菌Pestalotiopsis guepini 。这说明 产紫杉醇的内生真菌不仅存在于红豆杉属植物中，在一些非红豆杉属植物中也存在，他们的 研究进一步扩大了产紫杉醇内生真菌的范围。我国的学者在分离产紫杉醇内生真菌的研究中 也取得了可喜的进展。1994 年邱德友等从云南红豆杉( T .yunnanensis) 的树皮中分离到80 多 株真菌，其中一株可产紫杉醇。1993 年周东坡领导的课题组从百年以上的东北红豆杉( T. cuspidata) 的枝条与树皮中分离到3 株可产紫杉醇的内生真菌，发酵液中紫杉醇的产量可达 51106gPL125170gPL。其中 2 株菌被鉴定为树状多节孢 ( Nodulisporiumsylviforme) ，为我 国的新记录属、新记录种。张理珉等从云南红豆杉树皮分离出可产紫杉醇的内生真菌。马天 有等从中国红豆杉( T . chinensis) 树皮中分离到一株内生真菌，能产紫杉醇，产量为 14120gPL。王伟等从南方红豆杉( T.chinensis var. mairei) 的主干和侧枝树皮及皮下部分分离 得到91 株菌，其中6 株能分泌紫杉烷类化合物，经鉴定分别属于头孢霉属( Cephalosporium spp. ) 、轮柄梳霉属(Martensiomyces spp. ) 和无孢菌群( Mycelia sterlia) 。王建锋等也从南方 红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢菌，发酵产物分析表明可产紫杉醇，产量为18514g PL。陈 毅坚等报道从云南红豆杉( T . yunnanensis) 分离出的52 株内生真菌中，有 19 株菌的发酵产物 中有紫杉醇或紫杉烷类物质，分属于12 个属。胡凯等从南方红豆杉的树皮中分离得到的21 个内生真菌，发现有3 个菌株能够产生紫杉醇。到目前为止，人们已发现20 多种内生真菌 可以产紫杉醇，其寄主也不仅限于红豆杉属植物，从秃柏、Wollemi 松及Torreyagrandifolia 等非红豆杉属植物中也分离到了可产紫杉醇的内生真菌。 与过去从红豆杉植物的树皮中提取紫杉醇相比，内生真菌生产紫杉醇具有更大的优势， 真菌不仅能在简单的培养基上良好生长，产生大量的发酵产物，发酵周期短，还可以在生物 反应器中人为控制各种参数，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能以提高紫杉醇产量， 所以大规模工业生产容易实现，其应用前景十分广阔；而且对于植物来源的天然药物的新生 产途径的开发及濒危药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益，这样就为无限而有效 地产生紫杉醇药物开辟了新的途径。 四、 项目实施方案及实施计划 实施方案及实施办法： 1. 根据对产紫杉醇菌种的研究，从植物体内分离内生真菌，对菌种进行筛选，找到高效 产紫杉醇的菌株。关键一步是对植物组织表面进行消毒，以控制表生真菌的生长，使内生真 菌得以分离。目前常用次氯酸钠作为消毒剂，其分离方法是先用水冲洗植物材料，然后在75 %乙 醇中浸泡60s 后，在4 %次氯酸钠水溶液浸泡 0.5h ，然后在75 % 酒精中再浸泡30s ，最后用 无菌水冲洗。一般分离所用的培养基为1 %2 % 麦芽浸膏琼脂 MEA培养基。为了防止细菌 污染可在培养基中加抗菌素，如链霉素、四环素等。一般20 25 培养一个月左右。 2 紫杉醇的提取分离:真菌培养物首先要进行预处理，然后进行紫杉醇的提取。主要提 取方法是用有机溶剂萃取。将培养物冷冻后用转速为10000rpm 组织捣碎机匀浆3min，用4 层纱布过滤，滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(10:1，V/V) ，充分振荡后静置8h12h ， 收集有机溶液相，并在45 条件下减压蒸发，残留物溶于1mL 甲醇中作为样品溶液备用。 3. 紫杉醇的纯化。金涛等探索了对紫杉醇产生菌发酵液有效脱色作用同时制备高纯度紫 杉醇的树脂及层析条件。他采用了7 种树脂对紫杉醇产生菌发酵液进行脱色和提取，结果表 明201 4 型树脂处理样品的效果最好，利用80 % 的乙腈水溶液洗脱，紫杉醇的回收率达到了 98.8 %。从而为提取紫杉醇提供了一种操作简单、回收率高、污染较低的树脂层析方法。 4紫杉醇结构鉴定。采用质谱方法测定紫杉醇的结构。 5紫杉醇含量测定。采用高效液相色谱法测定。其色谱条件： Waters 高效液相色谱系 统，二极管阵列检测器；C18色谱柱，200mm 416mm; 柱温为室温；流动相为甲醇与水混合 物(V甲醇 :V水= 60:40) ；波长 228nm，流速110mLPmin ， 注射体积10L。 6优化培养基及发酵条件，进行大量培养。 具体实施计划： 2010 年 9 月2010 年 11 月 筛选目的菌株 2010 年