分子生物学答案

分子生物学答案 一、名词 1、鸟枪法（Shotgun method）：使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方 法。使用限制性内切酶将带有目的基因的 DNA 链切成若干小段，再使用 DNA 连接 酶将其整合到载体的基因中，并使其表达。 2、色氨酸操纵子（tryptophane operon）：负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够 的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp 基因表达，色 氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。 3、酶切图谱（Macrorestriction Map）：描述限制性内切酶的酶切点的位置和距离信息 的图谱。 4、原位杂交（in situ hybridization）：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂 交，称为原位杂交。 5、结构域（domain）：是构成蛋白质三级结构的基本单元，是指生物大分子中具有特 异结构和独立功能的区域，是蛋白质生理功能的结构基础，这种相对独立的区域性结 构就称为结构域。 6、DNA 杂交（Southern blotting）：又称为 Southern 杂交，即用放射性标记的探针与靶 DNA 进行杂交的技术。 7、基因组文库（genomic library）：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组 DNA，可 以得到大量的基因组 DNA 片段，然后将这些 DNA 片段与载体连接，再转化到细菌 中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基 因组 DNA 片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库 （短答案：是指采用基因组克隆的方法，克隆的一套基因组 DNA 片段。 ） 8、粘性末端（cos site-carring plasmid）：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列 处切断 DNA 时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸，叫做粘性末端。 9、一致序列（又称保守序列：conserved sequence）：遗传物质里的片段极少发生突变 而且在不同生物中广泛存在。 （长答案：在几种不同类型生物体中非常相似的 DNA 序列。科学家认为这些跨物种的相似性证明了某个特殊的基因完成了一些许多生命形 式所必须的基本功能，因此在进化过程中保留了这些序列，而很少发生突变。 ） 10、序列位置标签（Sequence Tagged Site，STS）：一段短的 DNA 序列（200-500 个碱 基对） ，这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在 PCR 反 应中可以检测出 STS 来， STS 适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定 DNA 的方向和特定序列的相对位置。 二、问答题 一、在分子克隆实验中为提高转化效率需注意哪些因素的影响？ 答：1、受体细胞的生长状态和密度。2、质粒的质量和浓度，主要是浓度比例要合 适，才能最大限度的与目的基因结合，达到最佳的转化效率。3、试剂的质量，主要是 指用于转化试剂的质量，各个厂家、一个厂家不同批次的试剂质量都可能存在很大的差 异。4、防止 DNA 污染和其他杂菌，主要是指实验所用的仪器设备都要注意彻底消毒 灭菌。 二、什么是同裂酶与同尾酶？及其在基因克隆中有何用途？ 答：同列酶：是来源于不同物种但能识别相同 DNA 序列的限制性内切酶，切割位 点可以相同也可以不同；同尾酶：即能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能 产生相同粘性末端的限制酶。这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但 产生相同的粘性末端. 三、简述 PKA 的特性，cAMP-PKA 途径的组成与机制及对基因表达调节作用？ 答案：蛋白激酶 A (protein kinase A，PKA)又称依赖于 cAMP 的蛋白激酶 A，是一 种结构最简单、生化特性最清楚的蛋白激酶。PKA 全酶分子是由四个亚基组成的四聚 体, 其中两个是调节亚基，简称 R 亚基，另两个是催化亚基，简称 C 亚基。R 亚基的 相对分子质量为 49-55kDa, C 亚基的相对分子质量为 40kDa,总相对分子质量约为 180kDa；全酶没有活性。在大多数哺乳类细胞中, 至少有两类蛋白激 A, 一类存在于胞 质溶胶, 另一类结合在质膜、核膜和微管上。激酶是激发底物磷酸化的酶,所以蛋白激酶 A 的功能是将 ATP 上的磷酸基团转移到特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上进行磷酸 化, 被蛋白激酶磷酸化了的蛋白质可以调节靶蛋白的活性。一般认为, 真核细胞内几乎 所有的 cAMP 的作用都是通过活化 PKA,从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的。 蛋白激酶 A（Protein Kinase A，PKA ）：由两个催化亚基和两个调节亚基组成（图 8-15） ，在没有 cAMP 时，以钝化复合体形式存在。cAMP 与调节亚基结合，改变调节 亚基构象，使调节亚基和催化亚基解离，释放出催化亚基。活化的蛋白激酶 A 催化亚 基可使细胞内某些蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，于是改变这些蛋白的活性，进一 步影响到相关基因的表达。 cAMP-PKA 途径： 四、简述真核基因在原核细胞表达的一般原理？ 答案：1、采用的主要表达方式有三种即（1）融合表达， （2）非融合表达， （3）及 分泌型表达。 （1）融合表达：是真核基因在大肠杆菌中使其表达融合的一部分及融合蛋白的氨 基端是真核序列，羧基端是原核序列。 （2）非融合表达：是指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白的 mRNA 的 A.U.G 为起 始，在氨基端不含任何原核蛋白序列。融合与不融合表达需要不同的载体。 （3）分泌型表达：是将外源基因整合到编码原核蛋白信号肽序列基因的下游来实 现的，当蛋白分泌到细菌周质时，信号肽被切除。 五、简述 hnRNA、snoRNA、snRNA 和 antisenseRNA 四个名词的含义及其一级结构的 特点？ 答案：1、hnRNA：在真核细胞核内可以分离到一类含量很高，分子量很大但不稳 定的 RNA，称为核内不均一 RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA） ，其平均分子长 度为 8-10kb，长度变化的范围从 2kb 左右到 14kb 左右。比 mRNA 的平均长度（1.8- 2kb）要大 4-5 倍。估计 hnRNA 仅有总量的 1/2 转移到细胞质内，其余的都在核内被降 解掉。 （短答案：Hn RNA 真核细胞核内一组转换极快、大小不一、分子量多超过 107kb 的 RNA 称为不均一核 RNA，包括基因转录的直接产物和部分加工产物。 ） hnRNA 的结构有以下特点： (1) 5端有帽结构； (2) 3端有 poly（A）尾巴； (3) 帽结构后有 3 个寡聚 U 区，每个长约 30nt； (4) 有重复序列，位于寡聚 U 区后面； (5) 有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧； (6) 非重复序列中有内含子区。 2、snoRNA：是位于细胞核仁中一类小分子非编码 RNA，在 rRNA 生物合成中起 着重要作用，是近来生物学研究的热点。已证明有多种功能，反义 snoRNA 指导 rRNA 核糖甲基化。核仁小 RNA 与其它 RNA 的处理和修饰有关，如核糖体和剪接体核小 RNA、 gRNA 等。核仁小 RNA 是一个与特性化的非编码 RNA 相关的大家族。 （短答案： 是一类小型 RNA 分子，可引导核糖体 RNA（rRNA）或其他 RNA 的化学修饰（如甲 基化）作用。 ） 3、snRNA：它是真核生物转录后加工过程中 RNA 剪接体（spilceosome ）的主要成 分。现在发现有五种 snRNA，其长度在哺乳动物中约为 100-215 个核苷酸。snRNA 一 直存在于细胞核中，与 40 种左右的核内蛋白质共同组成 RNA 剪接体，在 RNA 转录后 加工中起重要作用。另外，还有端体酶 RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制 有关；以及反义 RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。 4、antisenseRNA 即反义 RNA，是指与 mRNA 互补的 RNA 分子，也包括与其他 RNA 互补的 RNA 分子，由于核糖体不能翻译双联的 RNA，所以反义 RNA 特异性的互 补结合，即抑制了该 mRNA 的翻译。通过反义 RNA 控制 mRNA 的翻译是原核生物基 因表达调控的一种方式，最早在 E.coli 的大肠杆菌素的 Col E1 质粒中发现的，许多实 验 zhengming 在真核生物中也存在反义 RNA。近几年来通过人工合成反义 RNA 的基 因，并将其导入细胞内转录成反义 RNA，即能抑制某特定基因的表达，阻断该基因的 功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。细胞中反义 RNA 的来源有两种途 径：第一是反向转录的产物，即产生 mRNA 和反义 RNA 的 DNA 是同一区段的互补链。 第二种来源是不同基因产物，如 OMPF 基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关， 起反义基因是 MICFZE 则为另一基因。 六、简述 cDNA 探针和 cDNA 文库的概念及在分子克隆中的用途？ 答案：cDNA 探针：cDNA 是指互补于 mRNA 的 DNA 分子。cDNA 是由 RNA 经 一种称为逆转录酶的 DNA 聚合酶催化产生的，这种逆录酶是 Temin 等在 70 年代初研 究致癌 RNA 病毒时发现的，又称反向转录或逆转录。cDNA 文库：cDNA 文库的构建 是分子生物学领域的一项重要技术。cDNA 是以 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下， 在体外被逆转录为 cDNA 第一链，再以 cDNA 为模板，由大肠杆菌 DNA 聚合酶合成 第二链，得到双链 cDNA。由于组织或细胞的总 RNA 或 mRNA 中，含有该细胞的全部 mRNA 分子，因而被合成的 cDNA 产物将是各种 mRNA 拷贝的群体。当它们与质粒重 组后并转化至宿主细胞中，将得到一系列克隆群体，每个克隆仅含有一种 mRNA 信息， 所有克隆的总和则包含细胞内全部 mRNA 的信息，这种克隆群体则为 cDNA 文库。 逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。从逆 转录病毒中提取的逆转录酶已商品化，最常用的有 AMV 逆转录酶。利用真核 Mrna3末 端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆转录酶 催化下合成互补于 mRNA 的 cRNA 链，然后再用 RNase H 将 mRNA 消化掉，再加入大 肠杆菌的 DNA 聚合酶 I 催化合成另一条 DNA 链，即完成了从 mRNA 到双链 DNA 的 逆转录过程。 应用 cDNA 文库筛选和克隆新基因，是一条快速而有效的途径。也可从 cDNA 文 库中筛选出所需的目的基因，用于该基因的表达和研究。 七、质粒载体应具备哪些基本特征？并说明其理由。 答案：1 具有复制起点 这是质粒自我增殖必不可少的基本条件，并可协助维持使每个 细胞含有 10-20 个左右的质粒拷贝。通常，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独 立的复制子。但在少数情况下，有融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一 个有活性。 2 具有抗菌素抗性基因 一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为 寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制每识别位点上插入 外源 DNA 片段后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。 3 具有若干限制酶单一识别位点 这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而 且在其中插入适当大小的外源 DNA 片段之后，应不影响质粒 DNA 的复制功能。 4 具有较小的分子量和较高的拷贝数 低分子量的质粒首先易于操作，克隆了外源 DNA 片段后仍可有效的转化给受体细胞；而且这类质粒往往含有较高的拷贝数，这不仅有利 于质粒 DNA 的制备，同时还会使细胞中克隆基因的剂量增加；最后，低分子量的质粒 载体，对限制酶具有多重识别位点的几率也就相应降低。 八、简述 IP3-DG 信号转导系统的组成及作用机制？ 答：（1） 、IP3-DG 就是甘油二脂（DG）-蛋白激酶 C 途径。甘油二脂（DG）是该 途径的第二信使，它是肌醇磷脂的分解产物之一。当激素与受体结合后经 G 蛋白转导， 激活磷脂酶 C，由磷脂酶 C 将质膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）水解成三磷酸肌醇 （IP3）和 DG。 （2） 、IP3 和 DG 的作用：由 PIP2 水解产生的 IP3 是水溶性的小分子物质，离开细 胞膜后能在细胞质内很快地扩散， IP3 与内质网膜上的特异 Ca2+-通道结合后，就能使 内质网腔里的 Ca2+释放到细胞质，而且释放的 Ca2+具有正反馈效应，即释出的 Ca2+ 结合到 Ca2+通道，再促进 Ca2+释放。DG 的重要作用是激活蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC)，PKC 是一类 Ca2+依赖的蛋白激酶，能使选择性的靶蛋白的丝氨酸/ 苏氨酸残 基磷酸化。因 IP3 作用升高的细胞质内 Ca2+能使 PKC 从细胞质转移到细胞膜胞质面。 在 Ca2+，DG 和细胞膜磷脂成分中的磷脂酰丝氨酸的共同作用下激活 PKC。哺乳动物 中脑细胞的 PKC 浓度最高，其作用是使神经细胞的离子通道蛋白磷酸化，从而改变神 经细胞膜的兴奋性。在许多细胞中，PKC 能通过激活磷酸化级联反应，最后使一些转 录因子磷酸化并激活，从而调控相关基因的表达。 （作用（短答案）：IP3 使内质网腔里的 Ca2+释放到细胞浆。DG 的作用是激活 C 激酶，C 激酶再激活靶蛋白。对 C 激酶的激活还需 Ca2+和磷脂酰丝氨酸共同作用。 ） 九、何谓顺式作用元件和反式作用因子？反式因子的结构有何特点？ 答案：（1）顺式作用元件：顺式作用元件是同一 DNA 分子中具有转录调节功能的特 异 DNA 序列。按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。反 式作用因子：以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcription factors, TF)。 RNA 聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。在真核细胞中 RNA 聚合酶通常不能单 独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。与 RNA 聚合酶、相应的 转录因子分别称为 TF、TF、TF，对 TF研究最多。 （2）反式因子的结构特点：螺旋-转角-螺旋：是最早发现于原核生物中的一个关键 因子，该结构域长约 20 个 aa，主要是两个 -螺旋区和将其隔开的 转角。其中的一个 被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与 DNA 序列相识别的氨基酸。锌指： 长约 30 个 aa，其中 4 个氨基酸（ Cys 或 2 个 Cys，两个 His）与一个 Zinc 原子相结合。 与 Zinc 结合后锌指结构较稳定。同源域：最早来自控制躯体发育的基因，长约 60 个 氨基酸，其中的 DNA 结合区与 helix-turn-helix motif 相似，人们把该 DNA 序列称为 homeobox。主要与 DNA 大沟相结合。亮氨酸拉链：是亲脂性（ amphipathic）的 螺 旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔 6 个 残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）组成 DNA 结合区。碱性螺 旋-环-螺旋（ basic helix-loop-helix）该调控区长约 50 个 aa 残基，同时具有 DNA 结合和 形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性 -螺旋，两个螺旋之间由环 状结构相连，其 DNA 结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。 十、什么是配体和受体，受体是如何分类的，简要说明受体的作用特点？ 答案：配体：同锚定蛋白结合的任何分子都称为配体。在受体介导的内吞中, 与细胞质 膜受体蛋白结合, 最后被吞入细胞的即是配体。受体：在细胞生物学中是一个很泛的概 念,意指任何能够同激素、神经递质、药物或细胞内的信号分子结合并能引起细胞功能 变化的生物大分子。 受体分类 （1）胞内受体：甾类激素等 （2）细胞表面受体：水溶性多肽激素等 受体作用特点 （1） 受体与配体结合的特异性这是受体的最基本特点，保证了信号传导的正确性。配 体和受体的结合是一种分子识别过程，它依靠氢键、离子键与范德华力的作用使两者结 合，配体和受体分子空间结构的互补性是特异性结合的主要因素。特异性除了可以理解 为一种受体仅能与一种配体结合之外，还可以表现为在同一细胞或不同类型的细胞中， 同一配体可能有两种或两种以上的不同受体；同一配体与不同类型受体结合会产生不同 的细胞反应，例如肾上腺素作用于皮肤粘膜血管上的 受体使血管平滑肌收缩，作用于 支气管平滑肌等使其舒张。 （2） 高度的亲和力 （3） 配体与受体结合的饱和性 十一、举例说明原核生物基因转录的两种正调控的类型及其机制？ 答：正调控是（正控制） ：在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入某种调 节蛋白质后基因活性就被开启，这样的控制系统就叫做正控制系统。其调节蛋白质叫做 无辅基诱导蛋白。 例子：乳糖操纵子（1）乳糖操纵子的结构 大肠杆菌的乳糖操纵子含 Z、Y 及 A 三个结构基因，分别编码 -半乳糖苷酶、透 酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列 O、一个启动序列 P 及一个调节基因。 基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O 序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。 在启动序列 P 上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白 CAP 结合位点，由 P 序列、 O 序列和 CAP 结合位点共同构成 LAC 操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调 控区调节，实现基因产物的协调表达。 （2）阻遏蛋白的负性调节 在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，基因列在 P 启动序列操纵下表 达的乳糖阻遏蛋白与 O 序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对， 偶有阻遏蛋白与 O 序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子 半乳糖苷酶、 透酶生成。 当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催 化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数 -半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。 后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与 O 序列解 离、发生转录，使 -半乳糖苷酶分子增加 1000 倍。 （3）CAP 的正性调节 分解代谢物基因激活蛋白 CAP 是同二聚体，在其分子内有 DNA 结合区及 cAMP 结合 位点。当没有葡萄糖及 cAMP 浓度较高时，cAMP 与 CAP 结合，这时 CAP 结合在乳糖 启动序列附近的 CAP 位点，可刺激 RNA 转录活性，使之提高 50 倍；当葡萄糖存在时， cAMP 浓度降低，cAMP 与 CAP 结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。 由此可见，对乳糖操纵子来说 CAP 是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。 两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。 （4） 对调节机制的解释 大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。 倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低 cAMP 浓度， 阻碍 cAMP 与 CAP 结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。 在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与 O 序列解聚，CAP 结合 cAMP 后与乳 糖操纵子的 CAP 位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。 。 2 色氨酸操纵子-色氨酸操纵子(tryptophane operon)负责色氨酸的生物合成，当培养 基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp 基因 表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由 于 trp 体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或 cAMP-CAP 的调控。 色氨酸的合成分 5 步完成。每个环节需要一种酶，编码这 5 种酶的基因紧密连锁在一 起，被转录在一条多顺反子 mRNA 上，分别以 trpE、trpD、trpC 、trpB 、trpA 代表，编 码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸 合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。 trpE 基因是第一个被翻译的基因，和 trpL 和 trpa（不是 trpA） 。trp 操纵子中产生阻遏 物的基因是 trpR，该基因距 trp 基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上 25min 处，而 前者则位于 90min 处。在位于 65min 处还有一个 trpS（色氨酸 tRNA 合成酶） ，它和携 带有 trp 的 tRNATrp 也参与 trp 操纵子的调控作用。 十二、目前有关原核生物核糖体的结构、功能以及 rRNA、tRNA 相互作用取得了的哪 些重要进展？ 答：功能：它是装配蛋白质的场所，参与的成分很多，功能复杂。核糖体的结构至 少满足如下部位：（1）.容纳 mRNA 的部位。 （2） .结合氨基酰-tRNA 的部位（称 A-位 点） 。 （3）.结合肽基-tRNA 的部位（称 P-位点） 。 （4）.形成肽键的部位（转肽酶中心） 。 结构：原核生物；70S 核糖体，有大小亚基组成，小亚基 30S，大亚基 50S。还有 rRNA 与它们结合在一起.只有大小亚基结合在一起才能发挥功能。 相互作用：（1）mRNA 结合部位和 16sRNA 的 3端，30s 亚基的平台区。 （2）有 两个 tRNA 结合位点，SD 序列位于 30s 亚基上。 （3）鸟甘酸酶活性位于 50s 亚基上。 （4）50s 亚基与膜结合部位距肽链出口较近。 重要进展：主要有以下 12 个方面：(1)RNA 转录、反转录、复制和转录后加工；(2) RNA 和蛋白质生物合成关系；(3)RNA 催化活性的发现与 RNA 世界；(4)一级和二级结 构的测定与模拟；(5)修饰核苷酸和具有生物功能小分子活性的核苷酸的发现；(6)各种 信息调控 RNA 的发现；(7) 重要的核酸工具酶的发现；(8)RNARNA、RNA DNA、 RNA蛋白质间的相互作用；(9)RNA 的生物合成，嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合 成；(10)RNA 的人工合成(我国 80 年代初人工合成酵母丙氨酸 tRNA 工作至今在国际上 享有很高声誊)；(11)RNA 研究的产业化；(12)RNA 研究中的各种新技术的进入等。 十三、如何从转化后获得的受体菌中筛选出含有目的基因的重组体？ 答：由体外重组产生的 DNA 分子，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主会 得到大量的重组体细胞或噬菌体。面对这些大量的克隆群体，需要采用特殊的方法才能 筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。同时也需要用某种方法检测从这些克隆中提取 的质粒或噬菌体 DNA，看其是否确实具有一个插人的外源 DNA 片段。即便在这一问题 得到了证实之后，也还不能肯定这些重组载体所含有的外源 DNA 片段就一定是编码所 研究的目的基因的序列。为解决这一系列的问题，从为数众多的转化子克隆中分离出含 有目的基因的重组体克隆，需要建立一整套行之有效的特殊方法。目前已经发展和应用 了一系列构思巧妙、可靠性较高的重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交 法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。 一、遗传检测法 遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子两种方 法。 1根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 (1) 抗药性标记插入失活选择法 (2) 半乳糖苷酶显色反应选择法 2根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 二、物理检测法 1凝胶电泳检测法 2.小规模制备质粒 DNA 进行限制酶切分析 3R 环检测法 三、核酸杂交筛选法 1原位杂交 2. Southern 印迹杂交 3. Northern 杂交 四、免疫化学检测法 1放射性抗体检测法 2免疫沉淀检测法 3表达载体产物之免疫化学检测法 五、DNA蛋白质筛选法 十四、以 Puc8/9 为例说明插入失活法的原理？ 答：pUC 载体是在 pBR322 质粒载体的基础上，组入了一个在其 5，端带有一段 多克隆位点的 lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 常用的插入失活方法有大肠杆菌 半乳糖苷酶失活和免疫功能失活两种。 原理：利用 半乳糖苷酶插入失活的载体 (如 gt ll、gt l823 等)，在生色 底物(Xgal)和诱导物(1PTG)存在时，与相应的 Lac宿主铺平板可形成深蓝色噬 菌斑。用这种载体进行克隆时，半乳糖苷酶基因的大部分被外源 DNA 片段取代， 所产生的重组噬菌体丧失 互补能力，在含有 X-gal 和 IPTG 的平板下形成无色 噬菌斑。因此，对于这类入噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。 在免疫功能插入失活型载体的基因组中与免疫功能有关的 DNA 区段中含有一、二 种限制酶的单一切点，当外源 DNA 片段由这些位点插入时，就会使载体所具有的合成 活性阻遏物的功能遭到破坏，而无法进入溶源周期。因此，凡带有外源 DNA 片段的重 组体只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源 DNA 插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，不同 的噬菌斑形态可作为筛选重组体的标志。这种类型的载体中的 gtl0 最为常用。 十五、构建一个高质量的表达载体应考虑哪些因素和问题？ 答：1.启动子的结构特点：启动子是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并能起始 mRNA 合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不 能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对 mRNA 的合成极为重要。启动子区域： （1）Pribnow 盒，位于转录起始位点上游 510bp，一般由 68 个碱基组成，富含 A 和 T，故又称为 TATA 盒或 10 区。启动子来源不同， Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。 （2）35 区，位于转录起始位点上游 35bp 处，故称35 区，一般由 10 个碱基组成。 启动子有强弱之分，虽然原核细胞仅靠一种 RNA 聚合酶就能负责所有 RNA 的合成， 但它却不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的 下游，才在原核表达系统中被转录。在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启 动子有 lac (乳糖启动子)、 trp (色氨酸启动子)、PL 和 PR( 噬菌体的左向和右向启动子) 以及 tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 终止子的结构特点：在一个基因的 3端或是一个操纵子的 3，端往往还有一特定 的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一 DNA 序列称为转录终止子(terminator) 。对 RNA 聚合酶起终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含 A/T 的区 域和一段富含 GC 的区域，GC 富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后 形成的 RNA 具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种，一种只取决 于 DNA 的碱基顺序；另一种需要终止蛋白质(p 因子 )的参与。在构建表达载体时，为下 防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游 插入一段很强的核糖体 RNA 的转录终止子。 2.SD 序列的位点：mRNA 在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存 在，即 S-D 序列以及 S-D 序列与起始密码子 AUG 之间的距离。在原核细胞中，当 mRNA 结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不 严格的，只有 RNA 和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。1974 年 Shine 和 Dalgarno 首先发现，在 mRNA 上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子 AUG 和一段位于 AUG 上游 310 bp 处的由 39bp