免疫放射分析技术(irma)：核素标记的抗体检测抗原

免疫放射分析技术（IRMA）：核素标记的抗体检测抗原 1968 年 Miles 和 Hales 建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了 与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂，在反应体系中加入过量的 抗体，待测抗原（或标准品）与和核素标记抗体进行全量反应，故亦称非竞争性免 疫分析法。 一、技术特点 1. IRMA 反应系统中应用的标记物为免疫球蛋白。易于提纯和进行碘化标记，标记 抗体的比活度较高，有利于提高分析的灵敏度，且不同抗体的标记方法基本相同； 而在 RIA 中应用的标记物是抗原。抗原种类繁多，化学结构各异，较难获得纯品， 标记方法亦多种多样。 2. 在 IRMA 反应系统中使用过量的标记抗体，直接与抗原结合，不存在竞争结合的 复杂反应，因此反应速度较快，即使使用亲和力较低的单可隆抗体，也能满足实验 要求；而在 RIA 中抗体是微量的，所以一定要用高亲和力的多可隆抗体 3. IRMA 使用的标记抗体和固相抗原在反应中都是过量的，只有待测样品加样误差 才会影响分析结果，因此 IRMA 的批内和批间变异（CV%）比较小；而 RIA 使用的抗 体和标记抗原在反应中是固定量的，加样误差可严重影响测定结果。 二、实验原理 将核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测抗原结合，未结合的标记抗体 通过和固相的抗原免疫吸附剂结合而去除，溶液中的放射性与待测抗原的含量呈正 相关。根据检测过程的操作步骤不同，有以下几种类型 1. 直接 IRMA 法 将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合，然后加入固相抗原免疫吸附 剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物，测定上清液中放射性强度， 根据标准曲线即可得知待测样品中抗原的含量。 2. 双抗体夹心 IRMA 法 在待测抗原内依次加入固相抗体和标记抗体，反应后形成固相抗体（Ab1）-抗原- 标记抗体（Ab2）复合物，洗涤去除游离的标记抗体，测定固相抗体或载体上免疫 复合物的放射性强度，根据标准曲线即可得知待测样品中抗原的含量。此法仅用于 检测有多个决定簇的多肽和蛋白质抗原。 3. 间接 IRMA 法 此法是在上述双抗体夹心法的基础上，进一步改良为用核素标记抗 Ab2 的抗体（羊 抗兔或抗鼠的 IgG），反应后形成固相抗体（Ab1）-抗原 -Ab2-*Ab3（标记抗抗体） 的四重免疫复合物。其中，Ab3 可作为通用试剂，可省去标记针对不同抗原的特异 性抗体。 4. BSA-IRMA 法 是将生物素-亲合素系统（BSA）引入免疫放射分析，建立的新一代 IRMA。此法最 大的优点是使用生物素化抗体和以核素标记亲合素为示踪剂，可以通用于甾体类、 前列腺素等小分子物质的检测。由于 1 个抗体分子上可标记数十个生物素分子，而 每个亲合素又可与 4 个生物素分子结合，从而产生多级放大效应。同时生物素与亲 合素之间的亲和力要比抗原抗体间的亲和力大 10 万-100 万倍，二者结合极为稳定， 因此，使其灵敏度、特异性和精密度都大大提高。目前一些超灵敏度的 IRMA 分析 试剂盒就是应用上述原理制成的。 三、试剂与材料 1. 标记抗体 2. 固定抗原吸附剂 3. 标准抗原 4. 待测样本 5. 计数仪和低温离心机 四、操作方法 以固相双抗体法测定血清中促甲状腺素（TSH）为实例 1. 按下表逐一加样（加样量为 ml，均设双复管） 标准管 T*检测管 0 0.15 0.5 1.5 4 15 60 150 TSH 标准品 200 200 200 200 200 200 200 200 待测血清 200 125I-TSH 抗体 100 100 100 100 100 100 100 100 混匀，37温育 120min 弃上清（T*除外，以下同），加 2ml 洗涤液，放置 2min 弃上清，再加 2ml 洗涤液，放置 2min 弃上清，将各管倒置在吸水纸上 2. 用 计数仪分别测量各管放射性强度，以两管 cpm 的均值表示，分别计算结合 率（B%，即 B/T *100%） 3.