二十二碳六烯酸(dha)生产工艺简介

二十二碳六烯酸（DHA）生产工艺简介 一、DHA 背景与意义 DHA（Docosahexaenoic acid, 22:6 4.7.10.13.16.19，全名二十二碳六烯酸） 是一种重要的长链多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid ，简称PUFA） ，属 于-3系列（分子结构式中第一个双键位于-COOH基团反侧的第三个键上，即 -3系列） 。人和其它哺乳动物只有4、5 、 6及9去饱和酶，缺乏9 以 上的去饱和酶,因此无法自身合成DHA，必须由食物来提供。 1、DHA 的结构和性质 DHA 的分子式为 C22H30O2,分子量为 328.48，分子结构为： DHA通常是顺式，但在某些异构酶作用下可变成反式。含有多个“ 戌碳双 烯”结构及5个活泼的亚甲基。这些活泼的亚甲基舍得 DHA极易受光、氧、过热、 金属元素（如Fe、Cu）及自由基的影响，产生氧化、酸败、聚合、双键共轭等 化学反应，产生以羰基化合物为主的鱼臭物质。 纯DHA为无色、无味，常温下呈液态，且具有脂溶性，易溶于有机溶剂， 不溶于水，熔点为45.544.1，所以在低温下仍然能保持较高的流动性。 2、DHA 的来源 2.1 海洋动物 海洋鱼类是提取DHA的主要来源。海产鱼类特别是中上层鱼类的油脂中含 有大量的DHA，如鲔鱼、秋刀鱼、远东沙丁鱼的油中 DHA的含量均在10%以上。 目前全世界鱼油的年产量在100万吨左右，理论上从中可提取1025万吨鱼油。 实际上由于分离技术等因素的限制，鱼油产量要低于上述数字、而且提取的鱼 油有相当大的部分被氧化和渗入人造黄油或起酥油中被消耗掉，真正可用于分 离DHA 的鱼油仅占少部分。除此之外还有贝类和甲壳类。 2.2 真菌类 有许多低级的真菌中含有较多的DHA，其中藻状菌类的DHA 含量尤为丰富， 是进行DHA商业性开发的潜在来源。比如高山被孢霉中的占其总脂肪酸的15% 以上，而破囊壶菌中的占总脂肪酸的含量可高达34%。 产DHA的真菌主要是较低级真菌中的藻状菌，主要有壶菌纲（Class Chytridomycetes）、卵囊菌纲（ ClassOomyceres）、霜霉目 （OrderPeronosporales）、水霉目（ Ordersaprolegniales）、结合菌纲 （ClassZygomycetes）、虫霉目（Order Entomophthorales）等，特别是破囊弧菌 Thraustochytriidae，已经报道有它的8个属30 多个菌种能够产DHA 。 2.3 海藻类 许多研究证实，在金藻类、甲藻类、硅藻类、红藻类、褐藻类、绿藻类及 隐藻类等海藻中含有大量的DHA。到目前为止，已测定了上百个品种微藻的脂 肪酸，其中某些种类的海藻DHA含量可达30%以上。 3、DHA 的分离制备方法 如何高效地从鱼油及其他海洋动植物中分离、浓缩DHA，是脂肪酸开发应 用中的难点和关键之一。目前，实验室和实际生产中应用的和分离方法有低温 分级法、尿素包合法、溶剂法、成盐法、分子蒸馏法、超临界气体萃取法、脂 酶法及高效液相色谱法等。下面简要介绍其中几种重要的分离方法。 3.1 低温分级法 利用不同的脂肪酸在过冷有机溶剂中的溶解度差异来分离浓缩DHA。将鱼 油溶解在110 倍的无水丙酮中，并冷却至-25以下。混合液的下层即形成含有 大量饱和脂肪酸及低度不饱和脂肪酸结晶，而上层含有大量高度不饱和脂肪酸 的丙酮溶液。将混合液过滤，滤液在真空下蒸馏除去丙酮即可得到DHA含量较 高的鱼油制剂。为了提高分离效果可在无水丙酮中添加少量亲水性溶剂如水或 醇类。 3.2 溶剂提取法 利用不同脂肪酸的金属盐、在某种有机溶剂中的溶解度差异来分离浓缩 DHA。将乙醇、鱼油及NaOH按一定比例混合，然后力热使鱼油皂化。皂化后 的混合液经压滤分别得到皂液及皂粒。皂液在搅拌下加人H2SO4至PH为12。 分离上层粗脂肪酸乙醇混合液，加热回收乙醇，并反复水洗祖脂肪酸至中性， 即得DHA 含量较高的精制鱼油。 3.3 尿素包合法 脂肪酸与尿素的结合能力取决于其不饱和程度。脂肪酸的不饱和度越高、 则与尿素的结合能力越弱。依此原理即可将饱和脂肪酸、低度不饱和脂肪酸与 高度不饱和脂肪酸分离开来。在鱼油中加人尿素甲醇（或乙醇）后加热混合、 过滤并用适当溶剂萃取滤液，即得萃取液脱去溶剂、真空干燥后即得到DHA含 量较高的精制鱼油。 尿素包合法是一种比较简便有效的分离方法，但在实际生产中应用时，存 在溶剂损耗大、排水和因尿素添加物而引起的废物处理等问题。为此， Kazuhiko开发了一种尿素包合与连续精馏相结合的分离方法，既解决了上述问 题，又避免了鱼油因与空气接触而氧化，还可以提高分离效果，适合工业化生 产。 3.4 超临界气体萃取法 即将含有DHA的鱼油溶解于超临界状态的CO 2中，通过改变温度和压力， 达到分离DHA的目的。此法能分离出高纯度的DHA，但对碳数相同而双键数不 同的脂肪酸的分离效果较差。为此，可利用银离子能与双键络合形成可逆的络 合物的特性，在超临界CO 2萃取装置中增加1支AgNO 3硅酸色谱柱，达到将碳 数相同而双键数不同的脂肪酸分离的目的。 上述分离方法同样适用于通过选择和培养某些真菌和海藻来提取DHA的途 径。 4、DHA 的生理功能 4.1 抗凝血、抑制血栓形成 DHA能抑制血小板凝集，减少血栓素形成，从而预防心肌梗塞、脑梗塞的 发生。血小板合成的血栓素（TXA2）具有促进血小板凝集和收缩血管的作用， 血管内皮产生的前列腺素（PGI2）具有抑制血小板凝集和舒张血管的作用， TXA2 和PGI2 之间的平衡是调节血小板和血管功能，促进血栓形成的关键。 TXA2 和PGI2 是以花生四烯酸（AA）为前体，通过磷酸化酶的作用从细胞膜 磷酸甘油酯中释放出来。DHA和EPA可竞争性抑制AA向TXA2 和PGI2 转化而 生成TXA3 和 PGI3，TXA3 几乎没有生物活性，而PGI3 与PGI2 的生理功能和 活性相似，因而减少了血小板凝集并增加了血管舒张作用，使血栓形成减少。 对血栓病患者,可使患者的血小板存活时间延长,血小板计数减少, 血小板因子的 血浆水平下降， 血浆中血栓球蛋白降低，可阻止血小板与动脉壁相互作用，延 缓血栓形成。 4.2 降血脂、防动脉硬化 DHA可以降低血清中甘油三酯生成及从肝脏排出；降低低密度脂蛋白、极 低密度脂蛋白、增加高密度脂蛋白，改变脂蛋白中脂肪酸的组成，从而增加其 流动性；增加胆固醇的排泄，抑制内源性胆固醇的合成。因此，可以预防和治 疗动脉硬化，对高血压、心血管疾病有一定的治疗作用，被人誉为“心血管疾 病无可比拟的特效品”，是血管的“清道夫”。 4.3 抗炎作用 调查发现，爱斯基摩人很少患气管炎、风湿性关节炎等慢性疾病，用EPA 喂饲小鼠，其实验性炎症的水肿程度降低。原因：慢性反应物质SRSA是三种特 异的白三烯，是变态反应中的活性物质，在过敏性反应中调节支气管收缩和血 管通透性。花生四烯酸促进白三烯LTB4形成，LTB4有助炎作用；DHA和EPA 可促进白三烯LTB5形成，它几乎无生理活性，从而EPA具有抗炎作用。用- PUFA防治某些炎性疾病如类风湿性关节炎、带状泡疹及红斑、疤疹、哮喘等已 取得良好效果，是一种理想的功能性食品原料。 4.4 健脑作用 DHA 是人脑的主要组成物质之一，占人脑脂质的10%左右，在一定程度上 可以提高脑的柔软性，抑制脑的老化。其在人脑中主要以磷脂的形式存在，存 在于大脑的灰白质部，磷脂对脑细胞的形成和构造起重要作用，如果缺少神经 元的突起就不能维持，所形成的网状组织易被破坏，大脑传递信息就不灵，也 影响人的智力，记忆和思维能力。在脑细胞形成的过程中，DHA有利于脑细胞 突起的延伸和重新产生。在胎儿时期，从受精卵在母亲子宫内分裂开始就需要 DHA，因此，孕妇应摄入足量的DHA，以促进胎儿大脑的发育和脑细胞的增殖。 正常情况下，一位孕妇每天应摄入0.51.5 g DHA（普通人需要0.51.0 g），特 别是在胎儿大脑发育最快的妊娠第4个月至婴儿出生后1岁末未发育完成这一重 要时期，DHA 的摄入尤为重要。同样，幼、童及青少年也应该进补，他们正 处于接受大量信息的学习阶段，这对脑细胞是一种刺激，补充能保证脑细胞突 触延长，使神经细胞之间联系加强，信息的传递更为迅速，大脑功能增强，记 忆力提高。此外也是老年人不可忽视的营养素，补充可以延缓大脑萎缩，防止 大脑功能衰退和老年性痴呆症发生。因而，有人称DHA为“脑黄金”。 4.5 保护视力 在人体各组织细胞中，DHA 含量最高的是眼睛的视网膜细胞，DHA 能保 护视网膜、改善视力。一方面，DHA 能使视网膜与大脑保持良好的联系，防 止视力减退，改善视力；另一方面，充足的DHA能防止视网膜血栓的产生，阻 止脂质渗出，从而彻底改善视力，甚至复明。DHA 的含量减少，对光的敏感性 就降低，视力则下降。 4.6 抗癌作用 据文献报道英国专家发现并分离出导致癌症患者身体消瘦的一种物质。这 种名叫卡奇非克因子的物质类似荷尔蒙，这种蛋白质经血液到达人体内脂肪组 织后，直接使脂肪组织分解使人消瘦。而鱼油中的DHA和EPA可阻滞这种蛋白 质因子的形成，使肿瘤患者消瘦过程得到逆转，从而起到增强患者体质，进而 起到抗肿瘤的作用。 5、DHA 的合成、消化以及代谢 5.1 微生物合成DHA的代谢途径 微生物合成多价不饱和脂肪酸通常是在单不饱和脂肪酸基础上开始，合成 机制与高等生物一致，包括延长碳链和去饱和作用两个过程，分别由相应的膜 结合延长酶和脱饱和酶所催化，使碳链增长；脂肪酸脱饱和体系由微粒体膜结 合的细胞色素b5、NADH-细胞色素b5还原酶和脱饱和酶组成。微生物合成DHA 是从油酸开始，其脱饱和途径是- 3；供体(乙酰CoA或丙二酰单酰CoA)提供两 C原子，在 12、13位C 原子之间引入一个双键，形成亚油酸，再在15、16位碳原 子间引入一个双键，形成- 亚麻酸，再经进一步的碳链延长和脱饱和而形成 DHA，形成过程如下：油酸(18:12)亚油酸(18:2 9,12)a-亚麻酸(18:3 9,12,15)二十碳五烯酸EPA (20:55,8,11,14,17)DHA(22:64,7,10,13,16,19）。 5.2 DHA的消化吸收方式 DHA在体内的消化吸收与其他脂肪酸相比，差异很大。以甘油三酯形式存 在的DHA 为例，在小肠中，甘油三酯被肝脏分泌的胆盐乳化后，在胰脂肪酶和 肠脂肪酶的作用下，分解成甘油二酯、甘油一酯、脂肪酸和极少量甘油。这些 水解产物与胆固醇、溶血磷脂和胆盐共同形成一种水溶性的混合微粒，穿过小 肠绒毛表面的水屏障到达微绒毛膜以被动扩散的方式被吸收（胆盐除外）。 脂质在鱼体内的吸收和哺乳动物体内的吸收相似。摄食的脂肪在内腔水解 后，单甘油酯和游离脂肪酸以微团的形式通过扩散作用在肠道的上皮细胞被吸 收。在粘膜细胞内重新组装成甘油三酯，形成乳糜微粒，通过淋巴系统进入血 液循环。而长联脂肪酸（LFA）则只在胆盐乳化作用下就可被吸收，吸收后的 LFA仍需合成甘油三酯再通过淋巴进入血液循环。在人体，主要通过淋巴途径 和静脉途径吸收DHA，有人提出了第三途径即十二指肠途径。 一般来说，短链脂肪酸比长链脂肪酸易于被吸收，不饱和脂肪酸比饱和者 更易被吸收。鱼类对不饱和脂肪酸和短链脂肪酸的消化吸收率高达95，对饱 和脂肪酸和长链脂肪酸的吸收约为85。 5.3 影响DHA消化吸收的因素 首先，是脂肪酸的组分和结构差异对其被消化吸收的影响。有研究者认为 脂质来源及脂肪酸存在的形式的差异可能会影响吸收、分配和生物利用。以磷 脂形式存在的DHA比以甘油三酯形式存在的更易被吸收。甘油三酯被胰脂肪酶 水解成2- 甘油一磷酸和游离脂肪酸，而磷脂被胰磷酸脂酶A2水解生成溶血磷脂 和游离脂肪酸，离子化的脂肪酸和2-甘油一磷酸进入胆汁微团后和磷脂形成水 溶性混合颗粒，有助于无极性的脂类穿过小肠绒毛表面的水屏障到达微绒毛膜 被吸收。 脂肪酸在甘油三酯中的位置决定其是以2-甘油一磷酸酯还是以游离脂肪酸 的形式被吸收。当DHA在甘油三酯Sn-2位置上，它们最容易被吸收。一般情况 下，磷脂代谢重建酶可选择性地将不饱和脂肪酸置于甘油酯的Sn-2位置,而将饱 和脂肪酸置于Sn-1位置。 其次，是脂肪酸所含的基团或包容物的互相作用对其被消化吸收的影响。 摄食的磷脂所含的磷酸盐基团和氮基（主要是维生素B复合体），可能会在几 个代谢途径中互相影响；脂肪酸的磷脂源（来自鸡蛋蛋黄和动物组织）含有大 量的胆固醇，也会影响脂肪酸的消化吸收；此外，脂肪酸的消化率还与它的熔 点有关，含不饱和脂肪酸越多，熔点越低，越容易消化。 总之，影响DHA消化吸收的 因素很多，内外有之，而且不同物种和个体之 影响因素可能会相异，其机理正在研究中。 5.4 DHA在体内的存在形式 在哺乳动物和水产动物体内，DHA主要以磷脂形式存在，游离脂肪酸很少。 磷脂主要存在于细胞膜中。 5.5 DHA的分解代谢 天然不饱和脂肪酸多为顺式，需转变为反式构型，才能被氧化酶系作用， 进一步氧化分解。在生物体内，不饱和脂肪酸的氧化需要更多酶的参与才能顺 利进行，由于双键的存在，是DHA比饱和及单不饱和脂肪酸很难氧化分解。 n-3脂肪酸的氧化供能，主要是在过氧化物酶体和线粒体中通过-氧化进行。 DHA在大鼠肝中的代谢不能在线粒体内进行-氧化，而是通过被过氧化物酶体 氧化。人类皮肤表皮细胞对不饱和脂肪酸（PUFAs）的代谢表现出很高的活性， 皮肤表皮15- 脂氧合酶的活性非常高，可将2-高-亚麻酸（DGLA）转化为15-羟 基二十碳三烯酸，将EPA转化为15-羟基二十碳五烯酸，将 DHA转化为15-羟基 二十碳六烯酸。 DHA被哺乳动物吸收后，绝大部分被结合在甘油三酯。DHA 是哺乳动物和 鱼类生物膜的重要组成部分和一些激素的主要前体，DHA并不是作为机体的主 要能量来源，只是在特殊情况下，如饥饿时其他脂肪酸被大量利用后，DHA才 可能会被氧化分解。 6、DHA 的应用及开发前景 6.1 医药保健用品 由于 DHA 和EPA可增加脑部益智、保护视力、降血脂、防动脉硬化、抗 凝血等生理功能，目前市场上有大量的鱼油制品出售，其DHA+EPA的含量在 20%80%之间。一般每天服用 DHA+EPA约1 g会产生很好的保健效果。 6.1.1 DHA鱼油胶囊 目前，在国内外市场上，DHA和EPA的主要产品是鱼油胶丸，其含量为 30左右。 6.1.2 DHA乙酯胶囊 该产品主要将富含DHA的油与乙醇进行醋化，生成DHA 的乙醋，经提纯后， 含量可达90以上，作为医药品使用，售价每克达1万日以上。 6.1.3 DHA甲酯胶囊 主要是将富含DHA的油进行甲醋化, 从而得到DHA甲醋型鱼油制剂胶丸， 含量可达6070 。 6.1.4 微胶囊化DHA 该产品主要将密封于2030m微粒子中。胶囊的制法是将含DHA的精制鱼 油、乳化剂、抗氧化剂、玉米蛋白及有孔淀粉等混合调制后，加入乙醇、水， 再高温微粉末化。产品特点为氧化稳定性好，贮存天14后pov不上升，DHA含 量无减少。耐高温，180加热后贮存, 上述数值没有什么变化, 消化性能很好。 6.1.5 DHA为主的保健营养饮料 日本莱新药公司制成无鱼腥味且容易饮用的DHA保健营养饮料。根据动物 实验的结果, 得出人类每日须摄取0.51.0g DHA。该公司研制的DHA 饮料每瓶 500mL，价格300及500日元二种。产品中除含DHA 外，也含有EPA、紫苏油、 红花油、天然维生素、蜂王乳、大蒜精、胡罗卜素、人参精、茶叶萃取物、蜂 蜜、葡萄糖、果糖等。 6.1.6 DHA粉末 将鱼油精制后制成化学性能稳定的DHA粉末。可将该产品直接添加到人造 奶油、蛋黄酱、冰淇淋和面包等功能性食品中去。 6.2 食品工业 目前，国际上已开发出了 DHA 和EPA 婴儿奶粉，DHA 饮料，富含DHA 和EPA 的鸡蛋、香肠、罐头等多种食品。 6.2.1 DHA酱油 日本相模中央化学研究所和洼田味增酱油公司共同研究开发出含DHA成份 的酱油新产品。鱼油中的鱼腥味一般很难脱除，但酱油中含有一种称之为“曲 酸”的成份具有消除腥臭味的功能。为此, DHA成份添加入酱油中，腥臭成份 便自然消减, 并利用乳化剂等解决了DHA鱼油的上浮现象。 6.2.2 DHA的婴儿配方奶粉 明治乳业股份公司自1987年就开始销售添加了DHA油的婴儿配方奶粉。母 乳中含的DHA含量随着母亲的饮食不同而有很大差异。FAO/WHO 为了使婴幼 儿的大脑及脑网膜等发育正常, 把高度不饱和脂肪酸的摄取比例标准规定为-6 系/-3系。 除此之外，现在已开发和正在开发的产品还有，用各种维生素、矿物质、 必需氨基酸相结合的饮料食品，如病人专用饮料、儿童乳酸菌饮料。用纤维类 组合的方便食品、病后康复食品。用于鱼糕、鱼香肠之类鱼制品制成的高级食 品、提高水产贝类罐头的附加值。添加到牛奶、酸乳酪、胚芽等食品中。 6.3 饲料工业 淡水鱼类喂富含 DHA 的饲料，可大大提高其DHA含量，从而提高其品质； 养殖富含DHA的海藻作成饲料，将很有前途，日本人用含DHA 的鱼粉喂母鸡， 结果生产出了富含DHA的鸡蛋“健脑蛋”。 二、DHA 生产工艺研究 1、从鱼油中获得 DHA DHA 主要是从鱼油中分离制备，具有代表性的沙丁鱼，金枪鱼、黄金鱼和 肥壮金枪鱼。但 DHA 含量高且可作为提取 DHA 原料的是金枪鱼和铿鱼油。 从鱼眼窝脂肪酸中提取 DHA 的工艺如下： 鱼头摘出眼窝脂肪分煮沸抽提油层分离脱腊脱色脱 臭精制 DHA 油 但是随着渔业资源的日渐紧缺，从鱼油中提取 DHA 时也面临着一些问题： （1）从鱼油中提取的 DHA 因胆固醇含量高，并且带有鱼腥味，极大地影响了 产品的品质； （2）鱼油中 DHA 的含量又是随着鱼的种类、季节、地理位置以及人类的捕捞 时间等条件的变化而变化； （3）在对鱼油进行加工过程中的氢化处理工艺降低了鱼油中的 DHA 产量，造 成了 DH 不必要的浪费； （4）由于一般鱼油中的 DHA 含量不是很高，同时还含有大量其他饱和及低不 饱和的脂肪酸，因而浓缩较为困难，加工处理过程复杂，从而提高了 DHA 生 产的成本，使得 DHA 的价格极为昂贵。故从鱼油中分离得到的 DHA 无论是数 量还是质量都难以满足社会的需求，另外从鱼油中纯化得到的 DHA 还具有一 定的难度。从而寻求廉价的 DHA 生物资源提取的可替代的新途径受到国内外 学者的广泛关注。 2、微生物合成 DHA 随着研究的继续深入，DHA 新的生理功效及作用机理不断被发现和揭示， 并且不少学者发现许多种类的海洋微藻以及海洋真菌都能自身合成 DHA，并且 其相对含量远远高于鱼油中的 DHA 含量，而 DHA 含量丰富多集中于海水金藻、 甲藻、隐藻、硅藻等海生异养微藻以及海洋真菌中的破囊壶菌和裂殖壶菌中， 而且主要以储存油和膜脂形式存在。 2.1 从微藻中获得 DHA 目前从海洋微藻中提取多不饱和脂肪酸的工艺还处于实验室阶段，目前主 要采取以下的步骤：藻体收集冷冻干燥脂肪酸萃取脂肪酸转酯化 分离纯化。 2.2 真菌发酵生产 DHA 利用真菌发酵生产 DHA 的研究主要集中在破囊壶菌 Thraustochytrium 和裂 殖壶菌 Schizochytrium，二者均来自海洋，是有色素和具光刺激生长特性的海生 真菌。利用真菌发酵生产 DHA 可以克服从鱼油获取 DHA 的不足，能够人为控 制影响因素，保持 DHA 产量和含量的稳定。真菌发酵生产 DHA 时，一般合成 EPA 及其他多不饱和脂肪酸较少，这有利于 DHA 的分离浓缩，制备高纯度 DHA。 微生物发酵生产 DHA 的研究已经取得一定的进展，但还存在以下的问题： （1）缺乏高产 DHA 的优质菌种，在发酵过程中菌体生长速率低，其脂质含量 和 DHA 含量不高； （2）DHA 微生物发酵研究大多停留在实验室的摇瓶阶段，没有大规模实现工 业化生产； （3）从微生物发酵液中提取 DHA 的方法还有待于进一步改进，以适应于工业 化的需要； （4）尚需探索微生物可利用的廉价底物，以降低其生产成本。 因此当前最迫切的任务是从自然界微生物资源中筛选高产 DHA 的优质菌 种，加强对 DHA 的发酵条件，代谢调控和工艺的研究。 理论分析 3、基本发酵工艺 工业发酵是利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的一门现代 工业，而现代发酵工程则是指直接把微生物（或动植物细胞）应用于工业生产 的一种技术体系，是在化学工程中结合了微生物特点的一门学科。因而发酵工 程有时也称作微生物工程。 3.1 基本概念 3.1.1 发酵一词的来源 发酵现象早已被人们所认识，但了解它的本质却是近 200 年来的事。英语 中发酵一词 fermentation 是从拉丁语 fervere 派生而来的，原意为“翻腾”，它 描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时的现象。沸腾现象是由浸出液中的糖在缺 氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。在生物化学中把酵母的无氧呼吸过 程称作发酵。我们现在所指的发酵早已赋予了不同的含义。发酵是生命体所进 行的化学反应和生理变化，是多种多样的生物化学反应根据生命体本身所具有 的遗传信息去不断分解合成，以取得能量来维持生命活动的过程。发酵产物是 指在反应过程当中或反应到达终点时所产生的能够调节代谢使之达到平衡的物 质。实际上，发酵也是呼吸作用的一种，只不过呼吸作用最终生成 CO2 和水， 而发酵最终是获得各种不同的代谢产物。因而，现代对发酵的定义应该是：通 过微生物（或动植物细胞）的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代 谢产物的反应过程。 3.1.2 发酵的定义 （1）狭义 “发酵”的定义 在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质 产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化 还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。 同时获得能量，丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。 （2）广义 “发酵”的定义 工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程， 它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧） 培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品即有细胞代谢产 物，也包括菌体细胞、酶等。 3.2 发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主 要特点如下： （1）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全， 要求条件也比较简单。 （2）发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少 量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用 它所需要的营养。基于这特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行 生物资源的改造和更新。 （3）发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强， 因而可以得到较为单的代谢产物。 （4）由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对 某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产 生比较复杂的高分子化合物。 （5）发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消 毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上 就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。 因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 （6）微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得 高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以 生产的产品。 （7）工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，开可以取得显著的经济 效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现 代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可 以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌来进行反应；反应设备 也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化 程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。 3.3 发酵的类型 根据发酵的特点和微生物对氧的不同需要，可以将发酵分成若干类型： （1）按发酵原料来区分：糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。 （2）按发酵产物来区分：如氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精 发酵、维生素发酵等。 （3）按发酵形式来区分，则有：固态发酵和深层液体发酵。 （4）按发酵工艺流程区分则有：分批发酵、连续发酵和流加发酵。 （5）按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为：厌氧发酵和通风发 酵两大类型。 3.4 发酵过程的组成部分 3.4.1 发酵过程的组成 除某些转化过程外，典型的发酵过程可以划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌； （3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产的容器中； （4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物萃取和精制； （6）过程中排出的废弃物的处理。 六个部分之间的关系如图所示。研究和发展计划，总是围绕着就逐步改善 发酵的全面效益而进行的。在建立发酵过程以前，首先要分离出产生菌，并改 良菌种，使所产生的产物符合工业要求。然后测定培养的需求，设计包括提取 过程在内的工厂。以后的发展计划，包括连续不断的改良菌种、培养基和提取 过程 3.4.2 发酵过程示意图 图 2 典型的发酵过程示意图 3.4.3 发酵生产的条件 （1）某种适宜的微生物 （2）保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧 pH 等） （3）进行微生物发酵的设备 （4）提取菌体或代谢产物，精制成产品的方法和设备 4、发酵后期酒精回收 工业生产中常常采用下图所示的流程进行操作。连续精馏装置主要包括精 馏塔，蒸馏釜（或称再沸器）等。精馏塔常采用板式塔，也可采用填料塔。加 料板以上的塔段，称为精馏段；加料板以下的塔段（包括加料板），称为提馏 段。连续精馏装置在操作过程中连续加料，塔顶塔底连续出料，故是一稳定操 作过程。 图 3 简易回收塔 （1）塔板的作用 塔板的作用是提供气液分离的场所；每一块塔板是一个混合分离器，并且 足够多的板数可使各组分较完全分离。因此每一块塔板是一个混合分离器，经 过若干块塔板上的传质后（塔板数足够多），即可达到对溶液中各组分进行较 完全分离的目的。 （2）回流的作用 回流的主要作用就是提供不平衡的汽液两相，而构成汽液两相接触传质的 必要条件。 注意：工业用精馏塔内由于塔顶的液相回流和塔底的汽相回流，为每块塔 板提供了汽、液来源。 三、DHA 生产理论研究 1、DHA 的代谢途径 1.1 DHA 的分解代谢 天然不饱和脂肪酸多为顺式，需转变为反式构型,才能被 -氧化酶系作用， 进一步氧化分解。在生物体内，不饱和脂肪酸的氧化需要更多酶的参与才能顺 利进行，由于双键的存在，使 DHA 比饱和及单不饱和脂肪酸更难氧化分解。 DHA 不能在线粒体中 -氧化，而是被过氧化物酶体氧化，皮肤表皮 15-脂氧合 酶的活性非常高，将 DHA 转化为 17-羟基二十碳六烯酸。 DHA 被哺乳动物吸 收后，绝大部分结合成甘油三酯。 1.2 DHA 的合成代谢 哺乳动物自身不能合成 DHA，但可由摄食的油酸、亚油酸或亚麻酸转化而 成。在动物体内，摄食的油酸或亚油酸主要转化为 AA，而合成的 DHA 极少且 缓，人体内 DHA 主要由植物油亚麻酸转化而来，由于转化涉及 3 种酶（其中 6 去饱和酶为限速酶）的代谢过程，因此转化效率较低。 微生物合成多价不饱和脂肪酸通常是在单不饱和脂肪酸基础上开始，合成 机制与高等生物一致，包括延长碳链和去饱和作用两个过程，分别由相应的膜 结合延长酶和脱饱和酶催化，使碳链增长；脂肪酸脱饱和体系由微粒体膜结合 的细胞色素 b5、NADH-细胞色素 b5 还原酶和脱饱和酶组成。微生物合成 DHA 是从油酸开始，其脱饱和途径是 -3；供体（乙酰 CoA 或丙二酰单酰 CoA）提供两 个碳原子，在 12、13 位 C 原子之间引入一个双键，形成亚油酸， 再在 15、16 位碳原子间引入一个双键， 形成 - 亚麻酸，再经进一步的碳链延 长和脱饱和而形成 DHA，形成过程如下： 图 4 代谢图分析 2、影响微藻培养生产 DHA 的理化因素 2.1 物理因素 影响微藻生长生产 DHA 的物理因素有光照、温度、溶氧量、盐度、pH 值 等。 （1）光照：脂肪酸的合成具有藻种的特异性。 （2）温度：不同的温度对藻细胞的生长具有较大的影响。随温度的升高，藻细 胞的代谢和呼吸作用加快，生长速率增大。而随温度的减低，藻细胞的代谢和 呼吸作用降低。细胞内的多不饱和脂肪酸累积量逐渐增大，DHA 含量也逐渐增 大。 （3）盐度：盐度对微藻脂肪酸组成的影响因种而异。一般来说，在高盐浓度下， 多不饱和脂肪酸的含量下降。而在适宜的盐度时，DHA 含量随着盐度的升高而 增大。 （4）溶氧量：在脂肪酸的代谢途径中，分子氧参与脂肪酸的去饱和过程是多不 饱和脂肪酸合成过程的限制因子，微藻发酵生产 DHA 的含量也受氧浓度的影 响。一般来说，高浓度的溶氧中生产的 DHA 含量大于低浓度中的 DHA 含量。 （5）pH 值：不同的微藻都有其适宜的 pH 值。它不仅影响了微藻细胞内外的 离子平衡，也影响了藻细胞膜的通透性。 此外，培养周期、培养密度、保存方式也对微藻生产 DHA 有影响。 2.2 化学因素 （1）碳氮比：培养基中的氮源组成主要影响微藻细胞内饱和及不饱和脂肪酸的 比例，当培养基中 C/ N 比升高时，Chlorellasorokiniana 细胞内多不饱和脂肪酸 的含量增大。同时培养基的碳、氮源的选择也影响了微藻生产 DHA 的产量， 这表现为不同的藻种对碳、氮源有不同的适应性。 （2）氯化钠：在海洋藻类中，钠离子的作用主要是调节细胞生长中胞内外的渗 透压。在高盐浓度下，藻细胞的细胞膜的流动性和渗透压降低，多不饱和脂肪 酸含量下降，DHA 的含量也下降，而低盐度下时 DHA 的含量较高。 2.3 微藻生产 DHA 的方式 （1）自养方式 对光合自养的微藻进行研究，发现一些光合自养微藻能产生 DHA。如光 甲藻和隐甲藻中，DHA 是磷脂酰胆碱的主要成分，特别是隐甲藻体内，将近总 脂肪酸的 50%的成分为 DHA。人们也已经从海藻中发现 DHA，含量占总脂肪 酸的 12%36%。光合自养微藻的大规模培养多采用开放式池、封闭式池和封闭 式光合生物反应器系统进行培养。 （2）异养方式 与自养培养方式相比，其具有培养过程无需光照，减少能量；可具有较大 的培养密度，可提高底物的转化率，缩短了发酵周期; 能控制温度、溶氧等培养 参数。 目前，已经成功地进行了隐甲藻异养及混养的研究。 2.4 影响真菌合成 DHA 的因素 2.4.1 培养基的组成 （1）碳源：真菌发酵生产 DHA 时，不同的碳源对生物量、菌体脂质量和脂质 DHA 含量都有极大的影响。总体而言，葡萄糖是较佳的碳源，生物量、菌体脂 质量、脂质 DHA 含量以及 DHA 产量都是较高的。葡萄糖也是油脂发酵生产中 最常使用的碳源，而且可被有效转化为油脂。 （2）氮源：氮的数量和来源对真菌合成多不饱和脂肪酸有着重要的影响。酵母 抽提物、 谷氨酸钠和胰蛋白胨有利于 Thraustochytriumaureum ATCC 34304 的 生长，其中以酵母抽提物的生物量最高，谷氨酸钠还有利于脂质的积累，各种 氮源对脂质 DHA 的含量影响不是十分明显，从 DHA 的产量看，酵母抽提物和 谷氨酸钠为较好的氮源。 （3）碳氮比：除了碳源、氮源外，培养基中碳氮比也影响真菌合成 DHA。 微 生物生长于碳源过剩、氮源不足，或者是剥夺氮源的环境，便会激发和促进脂 质的积累作为碳及能源的备用库。一般情况下高的碳氮比有利于脂质的积累和 促进菌体的生长，但碳氮比过高，脂质中 DHA 含量将会下降。 （4）无机盐及微量元素：在培养海洋微生物时，除非培养基中含有足够的所有 必需微量元素，否则，最好采用天然海水。由于破囊壶菌和裂殖壶菌均为海生 真菌，因此培养基中添加一定量无机盐是非常必要的。 （5）前体促进剂：一些有机酸和维生素对真菌合成 DHA 也是十分有用的 。 2.4.2 通气与搅拌 微生物合成多不饱和脂肪酸过程中的去饱和作用需要分子氧的参与，分子 氧的有效性决定其产生脂肪酸的不饱和度。因此，提高培养基中氧浓度有利于 不饱和脂肪酸的合成。机械搅拌对培养 Thraustochytrium 和 Schizochytrium 生 产 DHA 有不同的影响。由于 Thraustochytrium 缺乏细胞壁和富含不饱和脂肪酸， 细胞脆性大，机械搅拌抑制其生长。 但 Schizochytrium 的情况则不同，适当提 高搅拌速度能促进菌体的生长。另外，搅拌器的叶轮类型对菌体的生长也有影 响。 2.4.3 初始 pH 值 真菌生产 DHA 时,选择适宜的初始 pH 值也是十分重要的。 2.4.4 温度对 DHA 的生产有着极其重要的影响 嗜冷微生物比嗜温微生物能合成更多的多不饱和脂肪酸。许多研究也表明， 低温能促进微生物合成不饱和脂肪酸。Brown 和 Rose 认为，由于低温增加氧 的可溶性，产生大量胞内分子氧，有利于需氧参与的长链脂肪酸的去饱和作用。 另外，低温下，微生物产生大量多不饱和脂肪酸也是一种适应低温环境的手段， 因为多不饱和脂肪酸，特别是 EPA、DHA 能保持微生物细胞膜低温流动性，从 而维持细胞正常功能。 2.4.5 种龄和接种量 种龄显著影响 Thraustochytriumaureum ATCC34304 的脂质积累和 DHA 产 量，对生物量和脂质 DHA 含量影响不大，种龄 24h 和 5%的接种量时脂质积累 和 DHA 产量最高。 2.4.6 光照 破囊弧菌和裂殖弧菌为具有光刺激生长特性的海生真菌，因此，光照对其 生产 DHA 也有影响，Thraustochytriumaureum ATCC34304 在 33W 荧光灯光照 下的生物量、脂质量和 DHA 产量都比黑暗培养时高。 2.4.7 培养时间 破囊弧菌和裂殖弧菌发酵初期的生物量和脂质量呈线形增加，至对数生长 末期达到最高，此后，生物量保持平稳，而脂质量有所下降。DHA 含量随培养 时间变化并不明显。 目前，研究多不饱和脂肪酸的合成途径、去饱和酶基因的性质、藻细胞内 脂肪酸的组成、分布、DHA 合成的途径及合成前体物质等也为多不饱和脂肪酸 的工业化生产提供了更多的理论基础。 四、DHA 的分离提取 1、低温分级法 利用不同的脂肪酸在过冷的有机溶剂中的溶解度差异来分离浓缩 DHA。 即将总脂肪酸置于 110 倍的无水丙酮中 ,并冷却至 -25以下，混合液的下层 为饱和的脂肪酸和低度的不饱和脂肪酸结晶，而上层含有大量的高度的不饱和 脂肪酸的丙酮溶液，将混合液过滤，滤液在真空下蒸馏除去丙酮，就可得到较 纯的 DHA。 2、溶剂提取法 利用不同脂肪酸的金属盐在某种有机溶剂中的差异来分离浓缩 DHA。该种 方法是通过皂化后，在皂液加入 H2SO4，并将 pH 调至 12 ，分离上层粗脂肪 酸乙醇混合液，加入回收乙醇，并反复水洗粗脂肪酸至 pH 为中性。即可得相 对较纯的 DHA。 3、尿素包合法 脂肪酸与尿素的结合能力取决于其不饱和程度，脂肪酸的不饱和程度越高， 其于尿素结合的能力越弱。因而可将饱和脂肪酸、低度不饱和脂肪酸、高度不 饱和脂肪酸分离开来。然后，利用适当的溶剂萃取，真空干燥后可得到 DHA 含量较高的不饱和脂肪酸。 4、超临界 CO2 萃取法 超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，简称 SFE)是近代发展起来的 一种新型化工分离技术。它原理主要是将 DHA 溶于超临界状态的 CO2 中，通 过改变温度和压力，达到分离 DHA 的目的。它能够分离出较纯的 DHA，但是 对含有相同的碳数而双键不同的脂肪酸却效果较差。此外，现在还具有脂肪酶 水解法、膜分离法、硝酸银层析法、高效液相色谱法等。 5、酶法破碎 细胞破碎的方法而言可分为机械法和非机械法，机械法包括珠磨法、高压 匀浆法、超声波法和微波法等；非机械法包括溶酶法、酸热法和自溶法等。 酶解法是一种研究较广的细胞破碎方法，它利用酶反应，分解破坏细胞壁 上的特殊键，从而达到破壁的目的。 自溶法是一种特殊的溶酶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。 事实上，在微生物生长代谢过程中，大多都能产生一定的水解自身细胞壁上聚 合物结构的酶，以便使生长繁殖过程进行下去。控制一定条件，可以诱发微生 物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。目前 常用的自溶促进剂有食盐、乙醇、甲苯、硫醇等。某些试验是通过在菌液加入 NaCl 使其达到一定的浓度进行处理的。不溶固形物的含量随处理时间延长而减 少，这是因为 NaCl 溶液中，存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细 胞膜发生破裂，使得细胞水解酶与底物接触而被激活，分解细胞，原生质外溢， 胞内产物释放致使不溶固形物减少。 自溶作用是酶解的另一种方法，在一定程度上能用于工业生产，但对不稳 定的微生物则容易引起蛋白质变性，自溶后细胞培养液过滤速度也会降低。 其使用方法为：溶菌酶是专门作用于微生物细胞壁的水解酶，酶解条件为： pH 值 72 的 02 molL-1 的磷酸钾缓冲溶液， 08 molL-1 的氯化钾溶液，05% 的溶菌酶。在 30将菌体振荡不同时间后离心，菌体酶解后加入丙酮。影响因 素：温度、PH 、自溶时间等对自溶效果都有影响，根据菌体的不同而有不同的 影响。 酶法破碎的缺点：酶法避免了大量有机溶剂的使用，但酶作用的条件比较 苛刻，这给过程的操作带来麻烦。 目前很多是将酶法与其它各种细胞破碎方法结合起来，如酶解-超声波法， 酶解- 高压破碎法等。 五、DHA 的微胶囊化 1、概念 生物微胶囊是一种将生物大分子或微生物、动植物细胞，包封在一层亲水 性的半透膜内所形成的珠状微胶囊。生物微胶囊制备技术是 20 世纪末发展起来 的一项新型技术，它已在细胞和酶的固定化、微生物和动植物细胞大规模培养、 药物控制释放等诸多领域得到广泛运用，并展现出良好的发展前景。 微胶囊技术是指把分散的固体、液体或气体物质完全包封在一层半透膜中 形成微小粒子的技术。微胶囊通常是在囊壁内填入囊心（又称包容物）配制而 成。壁材是决定微胶囊性能的最重要因素，不同的应用条件对微胶囊壁材有不 同的要求。原则上，只要能够包囊芯材成膜的高分子材料都可作为微胶囊的壁 材。 天然或合成高分子材料是制作囊壁的良好基材。天然高分子材料主要有植 物胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、卡拉胶、琼脂等，其次是淀粉及纤维素衍生物， 如糊精、低聚糖、甲壳素等。国外开发了乳化性、成膜性及致密性良好的淀粉 衍生物作为包埋香精的壁材。此外明胶、酪蛋白、大豆蛋白、蜡(虫蜡、石蜡、 蜂蜡) 等也是很好的壁材。这类材料无毒或毒性很小、黏度大、易成膜，但机械 强度差，其中淀粉及纤维素不耐酸、不耐高温、易水解。人工合成高分子材料 主要有聚酯、聚醚、聚酰胺等。这类材料具有良好的机械性能，并且容易通过 化学或物理修饰进行控制。通常要根据芯材的物理性质来选择适宜的壁材，不 同的芯材需要不同类型的壁材。一种理想的壁材必须具有如下特点：（1）高浓 度时有良好的流动性，保证在微胶囊化过程中有好的可操作性能；（2）良好的 溶解性能；（3）在加工过程中能够乳化囊心形成稳定的的乳化体系；（4）胶 囊易干燥及容易脱落；（5）对于活性生物的微胶囊材料需有很好的生物相容性。 合成高分子壁材则可显示化学“裁剪”的优势。微胶囊囊壁的形状与所填 物质状态有关，一般来说，含固体的微胶囊形状与固体相同，含液体或气体的 微胶囊的形状为球形。微胶囊的大小一般在 21000m 范围内。囊壁因有许多 微孔而具有良好的半透性。液体囊心或水溶性囊心可以通过溶解、渗透或扩散 过程，透过囊壁释放出来。其释放速度又可以通过改变囊壁材料的化学组成、 厚度、硬度、孔径大小等加以控制。即使是致密壁材内的囊心，在控制压力、 紫外线强度等外界因素的作用下，也可以人们期望的速率释放出来。微胶囊的 特殊结构使囊心与外界环境相互隔离，使其免受外界温度、氧气和紫外线等因 素的影响；即便是性质不稳定的囊心，也不易发生化学变化。微胶囊的特殊结 构还可以使原本会发生反应的几种组分分开，使其“各自为政”，保持“原汁 原味”，并可根据需要控制它们的分离或混合。因此，根据不同特殊应用的要 求，制备有特定结构的含不同囊心的微胶囊，将它们搀杂到应用体系 中，能显著改善产品性能，提高其附加值，起到非同寻常的效果。 2、微胶囊技术的发展概况 微胶囊技术大概始于 20 世纪 30 年代，当时大西洋海岸渔业公司(Atlantic CoastFishers)提出了在液体石蜡中，以明胶为壁材制备鱼肝油一明胶微胶囊的方 法。20 世纪 50 年代，微胶囊技术开始取得重大成果，其中利用机械方法制备 微胶囊的先驱者是美国的 Wurster，在 40 年代末他首先采用空气悬浮法制备微 胶囊，并成功的用于药物包衣，至今仍常把空气悬浮法成为 Wurster 法。美国 NCR (国家先进出纳 )公司的 Green 是利用物理化学原理制备微胶囊的先行者， 50 年代初他发明了相分离复合凝聚法制备含油明胶微胶囊，取得了专利，并用 于制备无碳复写纸，在商业上取得了极大的成功，由此开创了以相分离为基础 的物理化学制备微胶囊的新领域。50 年代末到 60 年代，人们开始将聚合法应 用于微胶囊的制备，发表了许多以高分子聚合反应为基础的化学方法制备微胶 囊的专利，其中以界面聚合反应的成功最引人注目。70 年代以来，微胶囊制备 技术日益成熟，应用范围也由最初的药物包覆和无碳复写纸扩展到食品、轻工、 医药、石化、农业及生物技术等领域。 3、微胶囊的特性表征及传质规律 3.1 微胶囊的特性表征 微胶囊的主要功能是保护膜内物质和控制物质渗透，因此膜的强度和渗透 特性是微胶囊的主要性能指标。目前，国际上通用截割相对分子质量作为微胶 囊的重要性能表征。然而截割相对分子质量只反映了微胶囊对不同相对分子质 量溶质的阻隔能力，对于低于截割相对分子质量的溶质分子就不能予以反映。 鉴于微胶囊的阻隔作用与超滤膜(截留蛋白)和微滤膜(截留细胞)相仿，而微胶囊 传质机理则与透析相似。因此可以建立以下特性表征参数。 3.1.1 平衡分配系数 K 平衡分配系数是平衡状态下溶质在微胶囊中的浓度和主体溶液的浓度之比。 反映了微胶囊膜在平衡状态下对物质的整体透过能力。 3.1.2 截留率 R 截留率是溶质在主体溶液中的浓度和溶质在微胶囊中浓度之差占溶质在主 体溶液中的浓度的百分率。截留率反映了不同相对分子质量溶质通过微胶囊膜 的透过特性。 3.1.3 截割相对分子质量