煤层环境中微生物群落结构及其增产煤层气作用机理研究

煤层 环境中微生物群落结构及 其增产煤层气 作用机理 研究 摘 要 本文从微生物群落结构分析、煤层气 增产 效果 分析以及微生物对煤组分和结 构的影响三方面研究了微生物增产煤层气的作用机理 。 首先 采用 高通量测序技术 分析了 煤层 环境中 菌群 种类 和丰度 ；其次 采用 气相 色谱法和气体同位素判定法分 析了煤层气的组分和种类 ； 最后 采用 元素分析法、 红外光谱 法、 X 射线衍射法和 压汞法分别研究了微生物对煤样元素的种类和含量、官能团种类、微晶结构和孔 隙率的影响 。 研究 结果 表明 ，煤层 微生物 中的优势 菌种 （细菌和古菌）能够 产生 以 甲烷 为主 的生物 成因 气 ， 且 微生物 的 代谢作用 使煤 中 碳含量下降、含碳官能团 含量下降 ， 孔隙率 增大。该研 究能够为微生物增产煤层气技术的现场应用提供理 论指导。 关键词 ： 微生物 群落 ；煤 组分；煤结构； 生物 成因煤层气 The research of microbial community structure and its mechanism of producing coaled methane in coal seam Abstract This article carried out the research on mechanism of microorganism producing coaled methane (CBM) in three aspects, including the analysis of microbial community structure, the effect of increasing production of CBM, and the microbial influence of the component and the structure of coal. Firstly using high-throughput sequencing technology analysed the species and abundance of bacterial communities in the coal seam; Secondly using gas chromatographic and gas isotope determination method analysed composition and species of CBM, respectively; Finally this article adopted Elemental Analysis, Infrared Spectrometer (IR), X-ray Diffraction (XRD) and Mercury Porosimetry Analysed the microbial effect on the type and content of coal element, the type of functional group, the microcrystalline structure and the porosity. The results showed that, the main bacteria and archaea in coal seam can produce biogas which is mainly composed of methane, and microbial metabolism decreased carbon functional group levels and increased the porosity of coal seam. The study can provide a theoretical guidance for the field application of microorganism producing CBM technology. Keywords: Microbial communities； Coal composition； Coal structure； Biogenic coalbed methane 目 录 第 1 章 前言 1 1.1 微生物增产煤层气概述 1 1.1.1 微生物增产煤层气的定义 1 1.1.2 微生物增产煤层气的机理 1 1.2 国内外煤层气研究现状 4 1.2.1 国内现状 4 1.2.2 国外现状 4 1.3 本文研究背景及研究内容 5 第 2 章 煤层环境中微生物群落结构分析 7 2.1 实验方法 7 2.1.1 基因组 DNA 的提取与纯化 7 2.1.2 菌群种类和丰度测定 9 2.2 实验结果分析 10 2.2.1 基因组 DNA 分析 10 2.2.2 群落种类和丰度分析 11 2.3 本章小结 15 第 3 章 微生物增产煤层气的机理研究 16 3.1 增产煤层气效果分析 16 3.1.1 气体组分分析 16 3.1.2 气体同位素分析 22 3.2 微生物对煤组分和结构的影响 23 3.2.1 煤样品组分分析 23 3.2.2 煤样结构分析 27 3.3 本章小结 30 第 4 章 结论 32 致 谢 33 参考文献 34 第 1 章 前言 1 第 1 章 前言 煤层气是一种以甲烷为主要成分的天然气体，又称煤层甲烷，是煤的伴生矿 产资源，一般吸附在煤层表面，少数分布于煤孔隙或溶解在煤层水中。由于煤层 气是一种洁净能源，且具有气体轻、埋藏浅以及易于开采、经济价值高等特征， 近年来在国际上受到科研人员的广泛关注。我国的煤炭资源十分丰富，采煤的同 时伴随着煤层气的释放，因此煤层气储量也十分可观，总量位居世界第三。然而 由于我国煤体结构复杂，煤体构造破坏严重，占煤层气资源量半数以上的 “软煤 ” 普遍发育，其渗透率 仅有 (10-3-10-4)10-3 m2数量级 1-2， 严重制约了我国煤层气 产业的发展，因此亟需探索全新的煤储层增透技术。 由于煤层气按成因可分为生物成因煤层气和热成因煤层气，因此目前人们对 利用微生物降解煤生成甲烷这一观点逐渐达成共识，即只要温度、压力、 pH 值、 Eh 值、矿化度和营养物质满足微生物的生长要求，就可以把煤转化为以甲烷为 主的气体 3-7，且 微生物的代谢 速度 与煤颗粒 大小成 反比 ， 颗粒 越小产气效果 越 好 8。美国粉河盆地的煤层气开发表明微生物对煤的转化可以获得持续的煤层气 资源 9，澳大利亚 Apex 公司提出向煤层中注入甲烷菌可以刺激生物气的生成 10。 这 表明利用微生物对煤层气进行开发和利用具有重要的意义。 1.1 微生物增产 煤层气概述 1.1.1 微生物增产煤层气的定义 微生物增产煤层气 的 概念首先 由 Scott 提出 11。 他 指出，在 煤层中注入 厌氧 微生物种群 ，然后 加入微生物 生存 所需的有机物 ， 微生物 就能够将煤 逐步 降解， 从而 产 生 甲烷来 达到 增产煤层气的效果 。 而且 这一技术不 仅能够 增加煤层气的产 量 ，煤层的渗透性 也能 通过 微生物的降解作用 来 增加， 从而解决煤层气 开采困难 的问题 。 1.1.2 微生物增产煤层气的机理 微生物 增产煤层气的 机理 是 煤层中 的微生物在一定的 条件 下， 通过 降解煤产 生 以 甲烷为主的气体 。煤 是大分子化合物，一般来说 ，生成 甲烷的过程 可以 用 传 统生物气 产生的机理解释， 即 首先 生成酸 ，然后产氢，最后生成甲烷，如图 1-1 第 1 章 前言 2 所示。 但是 相对于 普通 的大分子有机物， 煤 分子中含有氧、氮、硫等元素，是复 杂的碳水化合物， 其中含有大量的杂环、苯环和脂环，结构 更加 紧密 ， 微生物作 用 时 产生甲烷的难度更大。 图 1-1 复杂有机质厌氧发酵产甲烷的代谢途径示意图 因此 Strapo 总结 出 了 微生物通过降解煤从而增产煤层气的可能途径 。降解 过程首先是 煤 大分子结构 分解 为小分子片段，即煤分子 中共价键 的 断裂 或是官能 团的 破坏 ； 然后在 多种微生物 的 共同相互作用下生成中间代谢产物； 再 经过微生 物的发酵作用后，将中间产物转化为 生成 甲烷所需要的底物，从而被 产甲烷 菌利 用生成甲烷 12。 第 1 章 前言 3 图 1-2 煤 的生物降解过程及中间产物 具体 过程如图 1-2 所示， “ 路径 1”为 煤样经过微生物处理过后，煤样被降 解为复杂芳烃有机物、聚合物及单体化合物 ，其中 这些复杂芳烃有机物、聚合物 及单体化合物被微生物的代谢 作用分解为带有羧基 、 羟基 、 羰基的脂肪酸、有机 酸 和 醇类等中间产物 ；“ 路径 2”表示 这些中间产物被进一步降解为甲烷底物 （ 二 氧化碳、乙酸及氢气等简单化合物 ）； “ 路径 3”为甲烷底物在产甲烷菌的作用 下形成甲烷。从图中 可以看出 中间 产物种 类 多样 ， 说明 煤层甲烷的产生需要多种 具有不同 代谢功能 的微生物参加 ， 相互配合共同完成 。 因此 ， 从煤到甲烷需要经过一系列的物质转化，煤层甲烷的产生需要多种相 互作用的微生物参加。产甲烷菌不具有直接分解有机质的能力，它主要以发酵菌 和产氢气产乙酸菌分解有机质而产生的 CO2、 H2 和 乙酸等作为碳源和能源，最 终生成甲烷。产甲烷古菌可分为三大类，第一类产甲烷古菌包括 Methanobacteriales、 Methanococcales、 Methanopyrales，多以 H2/CO2为底物，某 些成员可利用甲酸；第二类是 Methanomicrobiales，利用的底物类型与第一类产 甲烷菌类似，有些可利用仲醇；第三类是 Methanosarcinales，具有多细胞结构， 至少可以利用 9 种底物，包括 H2+CO2、一氧化碳、甲醇、醋酸、甲基胺、 2,3-甲 第 1 章 前言 4 基胺以及乙基二甲基胺等。 1.2 国内外 煤层气 研究现状 自上世纪 80年代提出生物成因气的概念以来 13， 世界上 许多国家 开始 涉足 微生物增产煤层气领域 。 利用地球化学方法，如同位素检测、煤层气的气体组 成分析等，世界 各地的生物 成因煤层气被源源不断的检测出来 14-16， 而且生物 成因煤层气 还 是 许多 煤田煤层气的主要来源 17-19。由此，现存煤层中是否存在 与生物成因煤层气产生相关的微生物，它们的活性如何、 如何作用 等问题成为 研究者关注的焦点。 1.2.1 国内现状 近年来，随着微生物 技术的发展 ，对煤层中生物成因煤层气微生物学的机理 有了进一步 认识， 煤层气田产出水和煤样中微生物的分析技术也得到了极大促进 和提高。我国对微生物增产 煤层气 的研究起步较晚，目前工作主要集中在模拟成 气实验方面，在厌氧细菌的计数、分离、富集培养方面 已经 取得了一定的成果， 但在煤地质微生物分离上还没有取得突破。 其中刘洪林等人从低煤阶煤层样品中分离出 来 产甲烷菌，并发现其中 含有的 产甲烷菌 在适宜的地质条件下能够分解煤层产生甲烷气体。苏现波等人研究了 微 生物生成甲烷的影响因素， 确定了产甲烷的最适 pH 为 8，否则会导致 甲烷含量 的减少 ；相比于 pH，盐度的影响较小，但当盐度超过 一定 值 时 ，甲烷的生成量 也会大幅降低 20。此外 ， 林海等人对产甲烷菌群进行了驯化，发现该菌群的产气 能力得到 显著提高。 在 新技术的支持下，虽然取得 了 一定成 果， 但 是在生物降解煤产甲烷方面 认 识 仍然不足，在代谢 过程中 有哪些微生物参与，各微生物在代谢过程中的 作用 如 何等问题 还需要 进一步探索 。 1.2.2 国外现状 在煤 层 微生物的研究 领域 ， 国外 已经 有很多经验 ， 相比于 国内的实验室实验， 对煤炭生物成气过程中微生物菌群的分离培养及其特性 研究 已有较多 成果 ， 已经 深入到分子化学水平 。 Michael 等人从粉河盆地煤层气井水样中富集培养获得了本源产甲烷菌， 第 1 章 前言 5 论证了该盆地的煤层中存在活性产甲烷菌群，且它们可以利用煤作为主要基质生 产甲烷 ； 并且利用 16S rRNA 序列分析，确定了不同微生物之间的进化关系和同 源性 21。 Singh 等人从煤层 水 水样中提取 DNA 后用古生菌和细菌的引物进行 16Sr RNA 扩增，并鉴定出有甲烷杆菌目和甲烷微菌目的微生物存在，这些微生 物以 H2和 CO2为基质合成甲烷。荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization， FISH)技术和 16S rRNA 焦磷酸测序在煤层水微生物的研究中也得到应用。 在煤层气开采 利用方面， 国外也 只有少数国家进入 大规模 工业化 生产，大部 分都处于基础研究阶段，煤层气 开发 利用 进程需要 进一步加快 。 1.3 本文研究背景 及 研究内容 通过 查阅文献了解到， 目前研究者 对微生物增产煤层气的 探索 正逐步增加， 对于生物成因煤层气的定义以及生物甲烷的形成过程也有了大量研究，微生物增 产煤层气 技术正 受到越来越多的关注。 但是 受到传统微生物分离培养方法的限制 ， 分离出的微生物仅占环境样品总数的 1% 10%， 不利于对煤层微生物种类的 全 面 分析 ， 阻碍了 对 煤层气形成机理的微观研究。 随着 分子生态学技术的发展， 采用高通量 测序技术可以 较好地 解决这一问题。 高通量测序技术 是一种能够进行深度测试的 分子生态学技术， 它的发展极大的 克 服了普通分子生态学技术的局限性，保证了 丰度较低 的物种 也 能正确 地 检测出来， 对 物种的 分析 更加准确。因此，本研究 首先 采用高通量测序技术对煤层中菌群的 组成和丰度进行分析，明确取样点环境中存在的优势菌群的种类 和 数量 ， 分析出 煤层环境中对生物甲烷代谢起有利作用的细菌和古菌种类 ， 为解析参与煤层有机 质降解形成甲烷的优势菌群提供科学依据。 在微生物 增产煤层气 的 作用机理方面， 虽然 对煤层气的形成过程 有了 一定研 究，但是 在产物 气体组分分析 以及 微生物对 煤 结构的影响方面还需 进一步 研究 。 因此，本研究内容针对 微生物与煤作用前 后的代谢产物及 华北油田提供的煤 样进行煤组分和结构分析，以明确微生物对煤层气增产 的 影响 机制 。采用 气相 色 谱 分析法 对 微生物作用后的代谢产物进行分析，明确微生物对煤的作用程度及煤 层气的成因类型 ； 运用 红外光谱法测定微生物代谢后煤样官能团的变化；采用 XRD 检测分析微生物作用 后煤 结构 的变化情况，以 及 压汞法 检测微生物作用前 后煤样孔隙率 及 孔径 的变化。 由此 总结出煤层环境中的 微生物 群落 及其对 煤的作 第 1 章 前言 6 用机理。 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 7 第 2 章 煤层环境中微生物群落结构分析 要深入研究煤生物成气的机理，必须 对 煤层微生物的种类 进行 全面分析。高 通量测序技术 是一种能够进行深度测试的 分子生态学技术， 它的发展极大的 克服 了普通分子生态学技术的局限性，保证了 丰度较低 的物种能正确 地 检测出来， 大 量的数据也使得 对 物种的 分析 更加准确。因此，本研究拟采用高通量测序技术对 煤层中菌群的组成和丰度进行分析，为解析参与煤层有机质降解形成甲烷的优势 菌群提供科学依据。 2.1 实验方法 2.1.1 基因组 DNA 的提取与纯化 高通量测序的前提是进行 DNA 的提取与纯化。高纯度和高浓度的 DNA 样 品能够减少高通量测序的误差，可以保证菌群分析结果更接近实际环境中的微生 物群落结构。本研究内容针对华北油田三个时段的煤层水样品，采用 CTAB 法 进 行了 DNA 的提取与纯化，为菌群的丰度分析、种类分析做准备。 实验仪器 （ a）抽滤装置 （ b）无菌操作台 （ c）琼脂糖电泳仪 （ d） DNA 浓度测试仪 图 2-1 基因组 DNA 提取与纯化实验仪器 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 8 实验样品 实验所用样品为华北油田同一口井（井 Z1-312）中三个不同时段所取的煤层 水样品，且保证三个时段的井内环境相同，三个样品分别标记为 “ Z1-312 2 月 20 日 ” ， “ Z1-312 3 月 16 日 ” 和 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 。 实验步骤 1. 取样 根据取样要求，在三个时段对煤层水样品进行采集，将样品分别装入无菌 桶内密封，静置。 2. 实验前准备 主要的实验前准备工作为 对实验用品进行高温灭菌处理 ，防止 外源菌对样品 中微生物 产生 污染。 3. 抽滤 （ 1）将煤层采出水放于 4 C 层析实验冷柜中化冻 3-4 天； （ 2）将全部采出水样品倒出，放于 70 C 烘箱 1 h，然后分装在 500 ml 分液漏 斗中进行分液以尽可能的分离油和水； （ 3）在超净工作台中组装抽滤装置； （ 4）使用循环水真空泵 将采出水 经定性滤纸过滤，再将滤液依次经过 不同 孔径 滤膜，分别把滤膜装在 50 ml 离心管中 待用 离心 。 4. 提取与纯化 DNA （ 1） 滤膜 加 5-7 ml SET 缓冲液用匀浆机打碎 ，离心 收集菌体； （ 2） 去掉 上清液后加入一定量的缓冲液及溶菌酶， 37 C、 150 rpm/min 温育 1 h； （ 3）加入 23 l 10%SDS和 5 l蛋白酶 K（ 40 mg/ml）， 37 C、 150 rpm/mim 摇 床温育 2 h； （ 4）加入 56 l CTAB-NaCl 溶液，轻轻颠倒混匀后， 65 C 水浴 20 min； （ 5）加入等体积的酚：氯仿：异丙 醇 =25:24:1 的混合液， 离心后 保留有机相 ， 如 此重复三次； （ 6）将上述离心管 4 C、 11000 r/min 离心 20 min，去上清；加入 500 l 70%冰 冷乙醇洗 DNA， 4 C、 11000 r/min 离心 10 min，重复一次后，尽量吸尽管 中的 液体，但注意不要吸到 DNA 沉淀，室温下干燥 DNA； 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 9 （ 7）用 20-100 l TE缓冲液（ pH=8.0）溶解 DNA； （ 8） 测定 提取的 DNA 浓度。 2.1.2 菌群种类和丰度测定 菌群种类分析是对样品中优势菌群的菌属类型进行统计 ， 其目的在于明确取 样点环境中存在的优势菌群的种类；菌群丰度分析是为了统计样品中微生物种类 的数量 ， 其目的在于明确取样点环境中存在的优势菌群的数量。本研究内容采用 高通量测序技术对煤层水中的细菌和古菌群落结构进行测定，并进行分类统计， 明确煤层水中细菌和古菌的 种类和丰度，分析出煤层环境中对生物甲烷代谢起有 利作用的细菌和古菌种类。 实验仪器 （ a）高通量测序仪器 （ b） PCR 扩增仪 图 2-2 菌群丰度和种类测试仪器 实验步骤 1. 16S rDNA 的 PCR 扩增和克隆文库的构建 DNA 提取与纯化完成后，采用细菌 16S rDNA 扩增通用引物 1492R（ 5- GGTTA CCTTGTTACGACTT-3）和 27F（ 5-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3） 进行 扩增。 采用通用引物 w017（ 6F， 5-ATTCYGGTTGATCCYGSCRG-3）和古 菌通用引物 w002（ 1509R， 5-GNTACCTT GTTACGACTT-3），进行古菌 16S rDNA 的 PCR 扩增。 设置适当 的 反应 条件进行延伸 。 上述 PCR 产物经纯化、补平和磷酸化后，连接到 PTZ18 质粒载体的 Smal 位 点上，转化大肠杆菌细胞。在含有 X-gal 和氨苄青霉素的 2YT 培养基上选择具有 氨苄青霉素抗性的白色转化子，构建 16S rDNA 文库。 2. RFLP 酶切分型和序列测定 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 10 对细菌文库克隆进行 PCR 检测， 并选用 合适的 限制性内切酶进行限制性内 切酶片 段长度多态性分析， 筛选得到不同的多态性克隆。 采用边合成边测序的方 法， 对 样品进行高通量测序 ， 从而 得到 16S rDNA 标签序列。 2.2 实验结果分析 2.2.1 基因组 DNA 分析 1. DNA 凝胶电泳图分析 DNA 琼脂糖凝胶电泳图如图 2-3 所示。 M 1 2 3 M 图 2-3 DNA 琼脂糖凝胶电泳图 图 2-3 中， M 代表 Loading Marker； 1 代表 “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品； 2 代表 “ Z1-312 3 月 16 日 ” 样品； 3 代表 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品。 图中 3 个样品均出现了 DNA 条带，都达到了进行高通量测序的标准 。其中 1 号样品的 DNA 条带较弱，说明 DNA 浓度较低； 2、 3 号样品的 DNA 条带较为 强，说明 DNA 浓度较高； 3 号条带出现拖带现象，可能是由酶的质量较差所导 致的。 2. DNA 浓度分析 上述各样品的 DNA 浓度如表 2-1 所示。 表 2-1 样品的 DNA 浓度 样品 Conc(ng/l) Z1-312 2 月 20 日 124.2 Z1-312 3 月 16 日 224.1 Z1-312 3 月 26 日 255.5 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 11 从表 2-1 中可以看出， “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品的 DNA 浓度最低， “ Z1- 312 3 月 16 日 ” 和 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品的 DNA 浓度较高，与 DNA 琼脂 糖凝胶电泳图的结果一致。 2.2.2 群落种类和丰度分析 如图 2-4，图 2-5 所示分别为各水样中细菌和古菌在属水平上的高通量相对 丰度图。图中的各种颜色代表一个菌属，每种颜色条块的高度代表该菌的相对含 量，因此高通量相对丰度图能够反映微生物的种类和相对含量。 图 2-4 三 个样品中的细菌在属水平的高通量相对丰度 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 12 图 2-5 三 个样品中的古菌在属水平的高通量相对丰度 对比三个样品中的群落结构可以看出， “ Z1-312 3 月 16 日 ” 和 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品中细菌和古菌的条块颜色较多，说明样品中细菌和古菌种类较多， 微生物丰度较大，所以这两个样品微生物的群落结构较复杂。 “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品中细菌和古菌的条块颜色较少，说明样品中细菌和古菌种类较少，微生 物丰度较低，所以这个样品微生物的群落结构较简单。 而且 “ Z1-312 3 月 16 日 ” 和 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品中细菌和古菌的高 通量相对丰度图颜色种类相似，但每种颜色对应条块的高度存在差异，表明水样 的菌群 种类相似而相对含量不同，即这两个水样的群落结构相似。与这两个样品 相比， “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品中细菌和古菌种类要少很多，说明该水样的细 菌和古菌群落结构与后两个样品的群落结构存在显著差异。 对比图 2-4 和图 2-5 发现，在同一样品中，古菌的高通量相对丰度图颜色种 类比细菌少，这说明在同一 时段内 古菌种类少于细菌种类。 此外，高通量相对丰度图中高度较大的颜色条块代表微生物群落结构中含量 较多的菌种，即优势菌 。从图 2-4 和图 2-5 中可以看出优势细菌和古菌种类如下： 1. “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品中的优势细菌和古菌 在 “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样 品中，细菌的优势菌种为硫磺单胞菌属 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 13 Sulfurospirllum （ 44.67%）和鼠孢菌属 Selenomonadales (19.12%)。而古菌的群落 结构较为简单，且所有的古菌均为产甲烷古菌，其中的优势古菌为 甲烷八叠球菌 属 。 2. “ Z1-312 3 月 16 日 ” 样品中的优势细菌和古菌 在 “ Z1-312 3 月 16 日 ” 样品的细菌群落结构中，主要的优势菌有厌氧绳菌 科 Anaerolineaceae_uncultured （ 15.11% ）、 Candidate_division_OD1_norank （ 13.57%）、生丝微菌属 Hyphomicrobium （ 9.43%） 等 。在此样品中古菌的种类 较多，其中优势古菌为甲烷杆菌属（ 57.77%）和甲烷 鬃菌属（ 30.41%）。 3. “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品中优势细菌和古菌 在 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品的细菌群落结构中，主要的优势菌有根瘤菌 Rhizobium（ 27.49%） 和 鞘脂单胞菌属 Sphingopyxis （ 14.73%） 。 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 和 “ Z1-312 3 月 16 日 ” 样品中的古菌群落结构相似，它们的优势菌也相 似，为 甲烷杆菌属 （ 56.14%）和甲烷 鬃菌属 （ 39.93%）。 微生物增产煤层气 的 原因 主要是甲烷代谢细菌和产甲烷古菌的作用， 因此 统计出样品中 有 利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的种类 及 含量。 表 2-2 “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的含量 分类 菌属 占细菌（或古菌）的比例 /% 占总菌数的比例 /% 甲烷代谢细菌 硫磺单胞菌属 44.670 43.638 固氮螺菌属 1.770 产甲烷古菌 甲烷八叠球菌属 99.210 6.040 甲烷杆菌属 0.605 甲烷食甲基菌属 0.186 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 14 表 2-3 “ Z1-312 3 月 16 日 ” 样品利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的含量 分类 菌属 占细菌（或古菌）的比例 /% 占总菌数的比例 /% 甲烷代谢细菌 Synergistaceae 5.140 6.925 苯基杆菌属 2.110 硫磺单胞菌属 0.040 固氮螺菌属 0.080 产甲烷古菌 甲烷杆菌属 57.771 6.012 甲烷鬃菌属 30.408 甲烷杆菌科 2.444 甲烷粒菌属 6.040 甲烷囊菌属 0.649 甲烷泡菌属 0.091 Methanoregula 0.056 甲烷八叠球菌属 1.466 甲烷螺菌属 0.600 表 2-4 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的含量 分类 菌属 占细菌（或古菌）比例 /% 占总菌数的比例 /% 甲烷代谢细菌 鞘脂单胞菌属 14.730 15.856 丛毛单胞菌科 2.140 产甲烷古菌 甲烷杆菌属 56.142 6.039 甲烷鬃菌属 39.934 甲烷杆菌科 2.768 甲烷粒菌属 0.298 甲烷囊菌属 0.019 甲烷泡菌属 0.470 甲烷八叠球菌属 0.298 甲烷螺菌属 0.063 第 2 章 煤层环境中 微生物群落结构分析 15 由 上述表格 可知 ： “ Z1-312 2 月 20 日 ” 样品中 有利于生物甲烷代谢的细菌 主要有硫磺单胞菌属（ Sulfurospirllum） 和 固氮螺菌属（ Azospira）， 古菌主要为 甲烷八叠球菌属；“ Z1-312 3 月 16 日”样品中有利于生物甲烷代谢的细菌有 Synergistaceae_uncultured、苯基杆菌属（ Phenylobacterium）、硫磺单胞菌属 （ Sulfurospirllum） 和 固氮螺菌属（ Azospira），古菌主要为甲烷杆菌属 （ Methanobacterium）和 甲烷鬃菌属（ Methanosaeta） ；“ Z1-312 3 月 26 日”样 品中有利于生物甲烷代谢的细菌有鞘脂单胞菌属（ Sphingopyxis）和丛毛单胞菌 科（ Comamonadaceae_unclassified）， 古菌主要为甲烷杆菌属（ Methanobacterium） 和 甲烷鬃菌属（ Methanosaeta）。 对比图 2-4、图 2-5 的 优势 菌种 可以看 出 ， 有利于 生物甲烷代谢的细菌和产 甲烷古菌 大部分 是样品中的优势菌种 ，因此样品 中 细菌 和古菌的优势菌种对 生物 甲烷的生成 起着 重要的作用。 此外 ，三 个 时段的样品中有利于生物甲烷代谢的细菌所占比例均比古菌高， 说明在生物甲烷的生产过程中细菌 起着 重要的作用。 2.3 本章小结 本章内容针对华北油田煤层水样进行了 DNA 的提取与纯化、菌群种类和 丰度分析等研究工作，得出结论如下： 1. 三组 样品微生物群落结构 差异 较 明显 ， “ Z1-312 3 月 16 日 ” 和 “ Z1-312 3 月 26 日 ” 样品微生物群落结构 比较相近 。 2. 同一样品 中古菌种类少于细菌 。 3. 样品 中 细菌 和古菌的优势菌种对 生物 甲烷的生成 起着 重要的作用。 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 16 第 3 章 微生物增产煤层气的机理研究 目前，人们对微生物利用煤作为原料生成甲烷逐渐达成共识，即只要温度、 压力、 pH 值、 Eh 值、矿化度和营养物质满足微生物的生长要求，就可以把煤转 化为以甲烷为主的气体 ，且煤颗粒越小微生物的代谢速度越快，产气效果越好。 但目前对于微生物增产煤层气的作用机制 尚不明确 ， 因此，本研究内容针对 微生 物与煤作用前后的代谢产物 及 华北油田提供的煤样进行煤组分和结构分析， 以明 确微生物对煤层气增产 的 影响 机制 。 3.1 增产煤层气效果分析 微生物与煤作用前后 代谢产物分析分为气体组分分析和 气体同位素 分析两 部分 。 通过气体组分分析 ， 能够测定微生物与煤作用产生的气体中甲烷含量和生 物气 种类 ，明确微生物对煤的作用程度 ；通过 气体同位素分析 ，能够 明确 煤层气 成因的类型， 进一步 了解 微生物甲烷代谢的机理。 3.1.1 气体组分 分析 色谱分析法 根 据 物质的 物理性质的不同， 可以 对混合物中各组分进行分离、 分析 ， 从而确定 煤层气 中的组分及含量。 因此本部分采用气相色谱仪对华北油田 微生物作用前后的煤层气样品成分进行了测定，明确生物作用煤层气的成分和含 量。 实验仪器 图 3-1 气相色谱仪 实验样品 实验样品 为 华北 油田 五 口井 中 的煤层 气，分别在 三个时间 （ 2 月 20 日、 3 月 16 日、 3 月 26 日 ）进行 取样， 采用 气相 色谱法对 气样进行 生物 气 种类和含量 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 17 分析。 实验步骤 将分析样品在进样口中气化后，由载气 （氮气 ）带入 色谱柱 ，通过 检测混 合物中的 色谱柱 ， 根据 不同的保留性能 使各组分分离 得到检测 信号 。 通过检测 顺序得到气体组分， 并且 可以通过检测峰的高度和 面积 得到各 气体 组分的含 量 。 实验 结果 分析 1. 2 月 20 日 气样结果 对 2 月 20 日 五 个气样的 分析结果如表 3-1 所示： 表 3-1 2 月 20 日气样种类和百分含量分析结果 组分 甲烷 乙烷 氢气 二氧化碳 氮气 氧气 V/V% V/V% V/V% V/V% V/V% V/V% 井 -1 77.735 0.037 0.107 5.459 16.662 / 井 -2 80.286 0.021 0.126 3.866 15.701 / 井 -3 79.705 0.038 2.548 8.350 9.359 / 井 -4 69.670 0.026 0.028 14.950 15.326 / 井 -5 86.914 0.079 0.026 0.639 12.342 / 由表 3-1 得，样品生物气种类 百分含量分析图 3-2 如下： (1) 井 -1 (2) 井 -2 (3) 井 -3 (4) 井 -4 (5) 井 -5 图 3-2 生物气种类 含量关系图 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 18 从表 3-1 及图 3-2 中可以看出 ，气体由甲烷、乙烷、氢气、二氧化碳和氮气 组成。其中甲烷含量最大，为 69.67% 86.91%，氮气含量次之，为 9.36% 16.66%， 二氧化碳含量第三，为 0.64% 14.95%，乙烷和氢气的含量均较小 ，且 气体中不 含氧气 。所以该气体主要以甲烷为主，符合煤层气的性质。但是 通过 对比 五个气 样 可以发现煤层气样品中甲烷含量的跨度很大，如图 3-3 所示。 图 3-3 气样中甲烷百分含量分布图 从图 3-3 中 可以看 出，煤层气中甲烷含量存在不均匀性。 2. 3 月 16 日 气样结果 对 3 月 16 日 五 个气样的 分析结果如表 3-2 所示： 表 3-2 3 月 16 日 气样种类和百分含量分析结果 组分 甲烷 乙烷 氢气 二氧化碳 氮气 氧气 单位 V/V% V/V% V/V% V/V% V/V% V/V% 井 -1 14.375 0.411 / 0.593 72.867 11.753 井 -2 21.891 0.058 / 0.769 68.748 8.533 井 -3 94.047 0.042 / 0.466 4.340 1.105 井 -4 93.488 1.098 / 0.588 3.733 1.093 井 -5 95.089 0.217 / 0.418 3.414 0.862 由表 3-2 得，样品生物气种类 百分含量分析图 3-4 如下 , 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 19 (1) 井 -1 (2) 井 -2 (3) 井 -3 (4) 井 -4 (5) 井 -5 图 3-4 生物气种类 含量关系图 从表 3-2 和图 3-4 中可以看出， 3 月 16 日 气样由甲烷、乙烷、氧气、二氧化 碳和氮气组成。气体组分与 2 月 20 日 气样明显不同，气样组分中多了氧气，少 了氢气。除了气体组分有变化外，气体的含量也发生很大变化。在“ 井 -1”和“ 井 -2”样品中，氮气含量最大，为 72.86%和 68.75%， 甲烷含量次之 ， 为 14.38%和 21.89%，氧气含量第三，为 11.75%和 8.53%，乙烷和二氧化碳含量均较低。 而 “ 井 -3”、“井 -4”、“井 -5”样品与 2 月 20 日 气样相比，气体组分虽然有变化， 但是气体含量变化很小。仍然 是 甲烷含量最高，为 93.49% 95.09%，氮气含量 次之，为 3.41% 4.34%，乙烷、氧气和二氧化碳含量均较低。 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 20 图 3-5 气样中甲烷百分含量分布图 从图 3-5 中可以看出 ， 前 二 个样品的甲烷含量很低 ， 后 三 个样品的甲烷含量 较高 ， 甲烷含量存在较大的不均匀性 。 2. 3 月 26 日 气样结果 对 3 月 26 日 五 个气样的 分析结果如表 3-3 所示： 表 3-3 3 月 26 日气样种类和百分含量分析结果 组分 甲烷 乙烷 氢气 二氧化碳 氮气 氧气 单位 V/V% V/V% V/V% V/V% V/V% V/V% 井 -1 95.572 0.020 / 0.917 2.828 0.663 井 -2 97.604 0.019 / 0.479 1.636 0.262 井 -3 95.543 0.033 / 0.822 3.053 0.542 井 -4 95.793 0.034 / 0.808 2.844 0.521 井 -5 95.979 0.027 / 1.068 2.292 0.634 由表 3-3 得，样品生物气种类 百分含量分析图 3-6 如下 。 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 21 (1) 井 -1 (2) 井 -2 (3) 井 -3 (4) 井 -4 (5) 井 -5 图 3-6 生物气种类 含量关系图 从表 3-3 和图 3-6 可以看出， 3 月 26 日 气样由甲烷、乙烷、氧气、二氧化碳 和氮气组成。与 3 月 16 日 气样相比，气体组分相同，气体含量也与 3 月 16 日 气 样中 的 “ 井 -3”、“井 -4”、“井 -5” 样品相似。其中，甲烷含量最大，为 95.54% 97.60%，氮气含量次之，为 1.63% 3.05，氧气、二氧化碳和乙烷含量均较小。 图 3-7 气样中甲烷百分含量分布图 从图 3-7 中可以看出， 3 月 26 日 样品的甲烷含量均较高，且比较均匀。 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 22 而且 通过对比 三组气样 中的甲烷含量可以 看出 ， 随微生物作用时间的 增长， 甲烷含量增加。说明微生物增产煤层气是一个持续的长期的过程 。 3.1.2 气体同位素分析 由于 煤 的成分和 结构受 到微生物或 热力 作用的影响 会发生 变化， 并且 有烃类 气体的形成。而 在 不同阶段 ， 不同成因类型的烃类气体具有不同的同位素特征。 其中生成 的 烃类气体基本都含有甲烷， 而 甲烷的碳同位素组成与其成因 密切 相关，因此 可以用甲烷的 13C 同位素特征来有效地判断烃类来源 ， 从 而确定煤层 气的成因。 实验仪器 Precon-GC/C-IRMS 联用系统。 实验 样品 本次 实验针对 提供 的三个时间 （ 2 月 20 日、 3 月 16 日、 3 月 26 日 ） 下 的 五口 井 中的气样进行了检测 。 实验步骤 （ 1） 使用 真空 收集瓶 收集大气样， 待测； （ 2） 设置 系统参数 ； （ 3） 对 收集到的 CH4进行富集浓缩 ， 收集空气样中 CH4燃烧产生的 CO2； （ 4） CO2进入微直径液氮冷阱 (-1960C)进行净化、浓缩和提纯，并经 GC 进 一步分离纯化，以高纯 CO2 为工作参考气，在线进行 CH4 碳同位素 测定。 实验 结果 分析 煤层气成因分为三种类型： 1、生物成因煤层气：由各类微生物的一系列复 杂作用过程导致有机质发生降解作用而形成的。 2、热成因煤层气： 煤分子结构 与成分 随温度升高 发生 变化而形成的烃类气体 。 3、 混合成因煤层气：由各种作 用复合产生。 一般 根据 甲烷碳同位素组成 (13C)来 判识生物成因气 类型 ， 国际上认为 13C1000 nm）、中孔（ 100 1000 nm）、小孔（ 10 100 nm）和微孔（ 10 nm）。 从表 3-7 中可以看出，未经微生物处理的煤样的孔隙率低于微生物处理之后 煤样的 孔隙率 ，说明微生物提高了煤的孔隙率。 通过 分析孔径分布可以看出， 煤样中孔隙大多数为大孔。且未经微生物处理 的煤样的最几可孔径小于微生物处理后煤样的最几可孔径，说明微生物对煤的降 解增大了煤样的孔径。 3.3 本章小结 本章内容 针对微生物作用 后样品中 的 气体组分和 同位素，以及微生物对煤组 分（元素和官能团）和煤结构（微晶结构和孔隙率）的影响两部分进行了研究， 所得结论如下： 1. 气体 组分分析 三 组 气样均有甲烷、乙烷、氮气和二氧化碳，除此之外，第一 组 气样中有 氢气，后两 组 气样中有氧气； 前两组 气样中甲烷含量不均匀 ， 第 三组 气样的甲烷含量最高且均匀； 随着 微生物对煤的作用时间增加，产气量在 逐渐 增加。 2. 气体同位素 分析 所测 煤层气 是微生物作用产生的，而不是热成因产生的 。 3. 煤样品组分 分析 微生物作用后，粉末煤（ FM）中 C、 S 元素 含量下降， N、 H 元素 含量上 第 3 章 微生物 增产煤层气 的 机理 研究 31 升；微生物作用后，煤样中 含氧官能团含量上升，含碳官能团含量下降 。 通过微生物 的 降解 作用，使 C 元素 转化为甲烷， 且 煤的颗粒越小代谢速度 越快。 4. 煤样结构 分析 微生物代谢后，芳香碳层面间距 d002 增大，堆砌度 Lc 和延展度 La 减小； 微生物对煤的降解作用使煤样的孔隙率和孔径增大。 第 4 章 结论 32 第 4 章 结论 本文利用高通量 测序技术对华北油田煤层水样 进行了微生物 菌群种类和丰 度 分析；采用色谱 分析法 和气体同位素判定法分析了微生物作用后煤层气 组分 和 甲烷 13C 同位素；采用 红外光谱 法、 X 射线衍射法和 压汞 法对微生物作用前 后煤组分（元素和官能团）和煤结构（微晶结构和孔隙率）进行了分析 。 得出 结论如下： 1. 虽然 3 个不同 时段样品 中 微生物 菌群 种类和结构 存在 差异 ，但是 3 个 样品 中有利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷 古菌 都是优势 菌种 ， 这 对生物甲烷 的 生成起着 重要作用 。 2. 微生物 降解煤 产生 的生物气中 含有甲烷、乙烷、氮气、 二氧化碳 、氢气 和 氧气等 ，其中 甲烷含量最高； 由于煤层环境中 微生物 种类和含量的差异 ， 甲烷含量不均匀 ；随微生物作用时间的增长，甲烷含量增加 。 3. 通过 气体 同位素 分析 可知 煤层气为 微生物代谢产生的 煤层气 ，而不是热成 因产生的气体 。 4. 微生物作用后，粉末状煤 中 C、 S 元素含量下降， N、 H 元素含量上升 ，块 状煤无明显规律 ； 并且 煤样中含氧官能团含量上升，含碳官能团含量下 降。说明通过微生物 的 降解 作用，使 C 元素 转化为甲烷， 且 煤 颗粒越小 ， 微生物 代谢 煤的 速度越快。 5. 微生物代谢后，芳香碳层面间距 d002 增大，堆砌度 Lc 和延展度 La 减小 ， 说 明 微生物 作用 加剧了煤大分子结构空间 排列 的不规则 性 ；微生物对煤的 降解作用使煤样的孔隙率和孔径增大，实现了生物增透，有利于煤层气的 解吸。 中国 石油大学（华东）本科毕业设计（ 论文 ） 33 致 谢 首先 感谢 我 的 指导老师 孙霜青副教授 在 本科毕业