苯丙酮尿症新生儿血斑中辅酶及葡萄糖等物质的分析

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 苯丙酮尿症新生儿血斑中辅酶及葡 萄糖等物质的分析 摘要苯丙酮尿症（PKU）是新生 儿先天性苯丙氨酸羟化酶缺陷所引起的 苯丙氨酸代谢障碍疾病。本研究采用超 高效液相色谱质谱联用技术，测定了 5 例 PKU 新生儿出生 3 天和出生 30 天后 的血斑与 20 例年龄相仿的正常新生儿 血斑中辅酶 Q10 的绝对含量和辅酶 Q9 的相对含量，其中，健康新生儿血斑中 辅酶 Q10 的含量为（122.124.9） ng/mL，PKU 新生儿组的含量为 （59.012.0）ng/mL。采用气相色谱质 谱联用技术测定了胆固醇和葡萄糖的相 对含量。研究结果表明，与对照组相比， PKU 新生儿血斑中辅酶 Q10、Q9、胆 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 固醇和葡萄糖的含量均显著降低，辅酶 Q10 的降低与血斑中苯丙氨酸含量升高 呈现显著反向相关。本研究结果为 PKU 患儿的饮食治疗方案提供了依据。 中国论文网 /8/view-12899708.htm 关键词苯丙酮尿症；辅酶 Q10； 胆固醇；葡萄糖 1 引言 苯丙酮尿症 （Phenylketonuria，PKU ）是一种由于 肝脏苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏或活 性减低而导致苯丙氨酸代谢障碍的常染 色体隐性遗传性疾病。辅酶 Q10（CoQ10）是一种小分子醌类化合 物，主要参与线粒体氧化磷酸化过程， 在营养物质在线粒体内转化为能量的过 程中起重要作用，且有明显的抗脂质过 氧化作用1 ，2 。人体的所有细胞中都 存在 CoQ103，在哺乳动物体内存在 有辅酶 Q9（CoQ9）4 。CoQ10 在个体 中含量差异主要受饮食和疾病的影响5， 人体的血液和生物组织中，90%以上 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 CoQ10 是还原型1，6，7。Artuch 等8在 1999 年首次报道了 PKU 患者体内 CoQ10 含量降低，通过饮食治疗的 PKU 患儿与相应年龄的正常对照组相比， 血清中的 CoQ10 含量显著降低。随后 的研究发现，PKU 患者血清中 CoQ10 降低主要是由于苯丙氨酸（Phe）含量 升高9。 苯丙氨酸有抑制胆固醇合成的作 用10， 11。 Hughes 等12发现，血清 中 CoQ10 的降低与血清中的胆固醇水 平有关。在 PKU 患儿病症与 CoQ10 和 胆固醇等含量关系的研究中，目前的研 究对象均为饮食治疗或控制的 PKU 患 儿与相应年龄的正常儿童，然而由于血 浆/血清中的 CoQ10 受饮食影响较大， 所以无法确定其差异变化源于疾病本身， 还是由于饮食差异。 人血清 CoQ10 的分析方法有色 谱分析法、分光光度法、比色法13、 电化学分析法14 和电泳法15 ，其中 反向液相色谱分析应用最为广泛，所使 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 用的检测器主要有紫外检测器16、电 化学检测器17，18 和质谱检测器 1925，其中质谱检测的选择性和高 灵敏度高。本研究采用超高效液相色谱 与三重四极杆质谱联用技术，进行新生 儿血斑中 CoQ10 的定量分析和 CoQ9 的 半定量分析，采用气相色谱质谱联用技 术（GCMS）测定胆固醇和葡萄糖，研 究了 PKU 新生患儿与正常新生儿之间 的 CoQ10、胆固醇以及葡萄糖含量差异。 2 实验部分 2.1 实验对象 PKU 新生儿与正常新生儿血斑均 来自吉林省妇幼保健院（已签署知情同 意书，并经伦理委员会同意） ，实验中 使用 S&S903 滤纸进行新生儿血斑采集， 正常新生儿组包括 20 例出生 3 天后的 新生儿血斑，PKU 新生儿组包括 5 例出 生 3 天与出生 30 天未经饮食治疗的 PKU 新生儿血斑。使用 1296071Delfia 血斑打孔器（PerkinElmer 公司）在滤 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 纸片上采集直径为 3.2mm 的圆形血斑 （相当于 3.4L 血液，可以保证每片血 斑中的血液含量是一致的27） 。血斑在 检测辅酶含量前，需在室温晾干处理至 少 24h；或将样品于 4保存待测。 2.2 仪器与试剂 WatersXevoTQ 质谱仪（英国 Micromass 公司） ，电喷雾离子源，数据 采集使用 MassLynx4.1 采集软件和处理 软件（Waters 公司，Manchester 公司， 英国） ；AcquityUltraPerformanceLC 超 高效液相色V 系统（美国 Waters 公司） ，配有自动进样器。6890Nnetworld 气 相色谱系统（美国 AgilentTechnologies 公司） ，配 5975inertXLMassselectivedetector 质谱检 测器，7683seriesG2614AN279 自动进样 器。 CoQ10、CoQ9、CoQ4，色谱级 氨水和氟化铵（美国 SigmaAldrich 公司） ；甲醇（色谱纯，美国 Tedia 公司） ；葡 萄糖标准品（D（+） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 Glucose，minimum99%GC，美国 Sigma 公司） ；其余试剂均为分析纯。实验用 水为超纯水（MilliQ，比利时 Millipore 公司） 。 2.3 质谱条件和色谱条件 质谱条件：采用正离子模式，多 反应离子监测模式进行检测，锥孔电压 和碰撞电压通过 Intellistart 功能进行优 化。离子源电压为 3.0kV，离子源温度 为 120，去溶剂温度为 500，去溶 剂气体流速为 800L/h，锥孔气流速为 50L/h。碰撞气氩气压力为 0.43Pa。使 用 QuanLynx 软件（Micromass，UK） 绘制标准曲线及进行定量分析。 超高效液相色谱分离条件： ACQUITYUPLCBEHC18 色谱柱 （50mm2.1mm，1.7m，Waters 公司） ， 流动相 A 为含 0.005%（V/V）氨水和 0.2mmol/LNH4F 的甲醇溶液，流动相 B 为纯水，以 AKG-3KG- 5B=99.9KG-3KG-50.1（V/V）等 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 度洗脱，流速为 0.45mL/min，色谱柱平 衡时间为 10min。流动相中的铵离子可 以增强辅酶在质谱中的信号。由于辅酶 的极性较小，在反相色谱柱中很难被洗 脱，最终确定采用纯水（流动相 B）与 添加 NH+4 的甲醇有机相（流动相 A） 为流动相进行分析。 2.4 血斑样品中辅酶的提取 取两片直径 3.2mm 的血斑，置 于 1.5mL 离心管中，加入 102L 含 0.1%甲 酸（V/V）的甲醇，超声提取 20min，11000r/min 离心 15min，取上清 液进行液相色谱质谱分析23。 2.5 胆固醇和葡萄糖的 GCMS 分析 取一片直径 3.2mm 的血斑，加 入 100L 双（三甲基甲硅烷基）三氟乙 酰胺（Bis（ trimethylsilyl） trifluoroacetamide，BSTFA）和 50L 吡 啶，振荡混匀后，70反应 2h，11000r/min 离心 5min，取上清液进 行 GCMS 分析。 GCMS 仪器设置条件： 初始柱温 70，保持 1.5min；以 20 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 /min 升温至 220，保持 5min；以 10/min 程序升温至 230，保持 5min；以 10/min 程序升温至 280， 保持 5min，每个样品的运行时间为 30min。无分流进样，进样体积 1L。 载气为氦气，总流速为 7.8mL/min。HP5MS 毛细管柱 （0.25mm30m0.25m，Agilent19091 S433） 。电子轰击离子源，正离子模式 检测，电子能量 70eV，离子源温度 280。 3 结果与讨论 3.1 串联质谱参数的确定 通过直接进样分析模式优化质谱 条件，辅酶标准品用实验中的流动相溶 解，进行质谱检测。优化后 3 种辅酶的 准分子离子M+NH4+与特征分子 离子组成的定量离子对及其它质谱参数 见表 1。在正离子质谱条件下， CoQ10，CoQ9 和 CoQ4 的准分子离子 M+NH4+ 分别为 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 m/z880.7，m/z812.4 和 m/z472.6，特征 子离子 m/z197.0 代表的是辅酶碎片离子 苯醌环结构。 3.2 方法的分析性能 以不同浓度 CoQ9 和 CoQ10 的峰 面积与一定浓度内标 CoQ4 的峰面e 比值作为纵坐标，CoQ9 和 CM（44CoQ10 的浓度为横坐标，绘 制标准曲线。测定 CoQ10 线性方程为 y=4.180x-4.835，相关系数 R2=CM） 0.997，线性范围为 1.589.0ng/mL，检出限 （LOD ，S/N3）为 0.8ng/mL，定量限 （LOQ ，S/N10）为 1.5ng/mL。测定 CoQ9 线性方程为 y=15.238x- 0.798，R2=0.999，线性范围为 0.320.0ng/mL，LOD 为 0.2ng/mL，LOQ 为 0.3ng/mL。测定 CoQ9 和 CoQ10 的日内和日间精密度， 以及添加不同浓度辅酶标准品后的回收 率，日内和日间精密度（相对标准偏差） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 均小于 15%，回收率在 85.0%115.0% 之间，说明本方法准确、可靠。 3.3 血斑样品的分析 采用 UPLCMS/MS 方法分析新生 儿血斑样品（健康新生儿 20 例，经典 型 PKU 新生儿 5 例）中 CoQ9 和 CoQ10 的含量，其中 5 例 PKU 新生儿 血斑样品分别为出生 3 天和 30 天后采 集。PKU 是一种以智力低下为特征的先 天性代谢缺陷疾病，分为经典型和非经 典型两类。2 其中经典型是由于苯丙氨 酸缺乏或活性降低所致。图 1 为健康新 生儿与经典型 PKU 新生儿血斑样品中 CoQ9 和 CoQ10 的 MRM 离子流图。与 健康正常新生儿（图 1A）相比，PKU 新生儿血斑中（图 1B）CoQ9 和 CoQ10 的含量均显著降低。CoQ10 的信噪比 （S/N）均大于 10，可以进行定量分析， 而 CoQ9 的 3S/N10，所以仅满足定 性分析要求。 正常新生儿组 CoQ10 的含量为 （122.124.9）ng/mL（20 例新生儿出 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 生 3 天后采集的血斑） ，PKU 新生儿组 的含量为（59.012.0）ng/mL（分别为 5 例出生 3 天和 30 天后采集的血斑） 。 与正常新生儿相比，PKU 新生儿血斑中 CoQ10 的含量显著降低。如表 2 所示， 两组的 t 检验结果为 p0.001（4.110 0） 。此外，以峰面积大小进行相 对含量分析，在正常新生儿血斑中（图 1A）中可以定量检测到 CoQ9，而在 PKU 新生儿血斑中（图 1B）CoQ9 含 量低于方法定量限，表明 PKU 新生儿 血斑中 CoQ9 的含量与健康对照组相比 显著降低。 PKU 新生儿血斑中苯丙氨酸 （Phe）的含量采用本研究组已建立的 分析方法24 ，25 进行测定。PKU 新生 儿血斑中苯丙氨酸的含量与 CoQ10 之 间的含量如表 2 和图 2 所示，每个样品 重复测定 3 次，样品 15 号为 PKU 新 生儿出生 3 天后采集的血斑，样品 610 号为 PKU 新生儿出生 30 天后采 集的血斑，可见血液中 Phe 的含量越高， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 CoQ10 的含量越低。经典型 PKU 患儿 由于苯丙氨酸羟化酶缺乏或活性降低会 导致 Phe 代谢障碍，使血液中的 Phe 含 量显著升高，其血液中 CoQ10 的降低 可能是由于其自身的抗氧化作用所导致。 3.4 胆固醇和葡萄糖的 GCMS 的 结果分析 采用 GCMS 分析经衍生化处理 后的血斑提取样品25 ，根据谱库检索 对 和 型 D 葡萄糖以及胆CM（44 固醇进行归属，并测定其相对含量，每 个样品重复测定 3 次。由表 3 可知，与 正常新生儿相比，PKU 新CM） 生儿血液中的胆固醇、 和 型 D 吡ZH （喃型葡萄糖的含量均显著 降低，与 CoQ10 和 CoQ9 降低的结果一 致，均与血液中苯丙氨酸的含量呈反向 相关。 4 结论 测定了新生儿血斑中 CoQ10、CoQ9、胆固醇和葡萄糖的含量， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 结果ZH ）表明，与健康的新生儿相 比，PKU 新生儿出生 3 天后采集的血斑 和出生 30 天后（正常哺乳的情况下） 采集的血斑中上述化合物的含量均显著 降低，与血液中苯丙氨酸的含量升高呈 现反向相关。由于 CoQ10 在抗脂质过 氧化作用中起着重要作用，推荐在确诊 为经典型 PKU 患儿的饮食治疗中适当 提高 CoQ10 的摄入量。此外，针对 PKU 患儿血液中葡萄糖含量降低的情况， 建议在经典型 PKU 患儿的饮食治疗中 适当增加葡萄糖的摄入。 References 1CraneFL.J.Am.Coll.Nutr.，2001，20（6 ）：591-598 2HargreavesIP.Ann.Clin.Biochem.，2003 ，40（Pt3）： 207-218 3MilesMV，HornPS ，MorrisonJA，Tan gPH，deGrauwT，PesceAJ.Clin.Chim.Ac ta，2003，332（12）：123-132 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 4RuizJimenezJ，PriegoCapoteF，MataGr anadosJM，QuesadaJM，LuquedeCastro MD.J.Chromatogr.A，2007，1175（2）： 242-248 5HansenG，ChristensenP ，TchsenE，L 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