核输出蛋白在流感病毒感染与传播中的作用

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 核输出蛋白在流感病毒感染与传播 中的作用 摘要 核输出蛋白（ NEP）是一 个由甲型流感病毒第 8 段基因编码的约 为 14 kD 的蛋白。 NEP 最初被认为参与 病毒核糖核蛋白复合体的出核。相对于 流感病毒的其他几个蛋白，关于 NEP 的研究很少被报道。近年来，随着蛋白 立体结构的确定、研究的不断深入， NEP 在流感病毒活动中很多意想不到的 作用不断被发现。这些研究显示 NEP 参与病毒的转录和复制，促进 H5N1 禽 流感病毒在哺乳动物体内的适应以及参 与病毒的出芽。本文系统总结了 NEP 的功能，包括参与病毒核糖核蛋白复合 体的出核的过程、调节病毒聚合酶的活 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 性以及帮助 H5N1 禽流感病毒实现跨种 间传播等，为进一步研究 NEP 奠定基 础。 中国论文网 /6/view-12874533.htm 关键词 流感病毒；核输出蛋白； 蛋白结构；生物特性 中图分类号 R511.7 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 01（c）-0035-05 Abstract Nuclear export protein （NEP） is a protein encoded by segment eight of influenza A virus， about 14 kD. NEP was originally implicated in mediating the nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes. In contrast to other influenza virus proteins， NEP studies are rarely reported. Since then， with the determination of protein structure and the deepening of research， many unexpected roles for NEP during the influenza virus life cycle have begun to be discovered. These recent studies have -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 shown NEP to be involved in regulating viral transcription and replication， facilitating the adaptive processes of avian H5N1 influenza viruses in the mammalian hosts and efficiently releasing budding virions. The paper reviews the function of NEP that mediating the nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes， regulating the viral polymerase activity and facilitating the inter-species transmissions of avian H5N1 influenza viruses etc.， which provides a basis to further study. Key words Influenza virus； Nuclear export protein； Protein structure； Biological properties 流感病毒属于正黏病毒科，是引 起世界流感大流行的主要病原体，可以 引起人畜共患的疾病。甲型流感病毒可 以通过抗原漂移和抗原转换，不断地进 行变异来逃避免疫系统的攻击，且目前 使用的抗流感药物和疫苗都具有局限性， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 无法从根本上来解决问题。随着对流感 病毒新靶点的寻找，核输出蛋白 （NEP）越来越被人们所了解和重视。 本文主要对 NEP 的研究进行归纳和总 结，希望能对流感病毒本身和抗流感病 毒的研究提供椭 。 1 NEP 的概况 甲型流感病毒的基因组是由 8 段 负链 RNA 组成，一般可以编码 17 种不 同的病毒蛋白，某些毒株可能存在 18 种不同的病毒蛋白1。NEP 是流感病 毒 NS 基因编码的 4 种蛋白之一1-2 。 NEP 是前体 mRNA 剪接后的翻译产物， 只有 121 个氨基酸组成，主要参与新生 病毒核糖核蛋白（viral ribonucleoproteins，vRNPs）复合体的 出核。NEP 最初被认为只存在被感染的 细胞中，结构也没有确定，故命名为 NS2（non-structural protein 2） ，直到 1991 年 Richardson 等3 在纯化的病毒 颗粒中找到了 NS2 蛋白，被证明是一种 病毒的结构蛋白，而后 ONeill 等4 发 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 现在细胞核内新合成的 vRNPs 在出核 的过程中 NS2 蛋白起到了关键性作用， 所以重新命名为 NEP（nuclear export protein） 。NEP 与宿主之间存在着紧密 的联系，通过酵母双杂交实验已经证明 至少存在 39 种与 NEP 存在相互作用的 宿主蛋白5-6。宿主通过自身蛋白与 NEP 的直接作用来影响流感病毒的生命 周期，同时病毒也可以通过 NEP 与宿 主蛋白的作用来影响细胞的生长发育、 代谢等生命活动。 2 NEP 的蛋白结构 如图 1 所示，NS 基因是流感病 毒的第 8 段基因，全长约 890 个核苷酸， 主要负责编码 NEP 和 NS1 蛋白，某些 病毒株还能编码 NSP 和 NS3 蛋白7-8。 流感病毒的转录在细胞核中进行，在转 录过程中利用细胞的 pre-mRNA 的 5帽 子结构来作为病毒转录的引物9，然后 病毒 mRNA 进入胞质借助细胞的翻译 系统来合成病毒蛋白。NS 基因可直接 转录产生 NS1 mRNA，NS1 mRNA 上 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 存在着剪接供位和剪接受位，在真核细 胞内经 RED-SMU1 剪接体作用后切去 一段 472 个核苷酸长度的内含子生成 NEP-mRNA10-11，接着进入胞质合成 NEP。 NEP 由 121 个氨基酸组 成（图 2） 。人为条件下用蛋白酶对 NEP 进行水解，NEP 可分为对蛋白酶敏 感的 N 端（第 153 位氨基酸残基）和 对蛋白酶耐受的 C 端（第 54121 位氨 基酸残基）12 。C 端由两个 螺旋组 成，即 C1（第 6485 位氨基酸残基） 和 C2（第 94115 位氨基酸残基） ，中 间由小弯链接，形成反向平行的螺旋发 夹结构，这个结构使得 C 末端具备了既 亲水又疏水的两性特征12。第 78 位存 在着一个色氨酸残基，周围围绕着多个 谷氨酸残基，这些谷氨酸残基可以和 M1 蛋白的核定位信号（nuclear localization signal，NLS）序列产生静电 作用，对于 NEP 参与 vRNPs 的出核活 动非常重要13 。虽然对 N 端的结构还 不是很清楚，通过其他实验已经证明蛋 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 白的出核信号（nuclear export signal，NES）序列存在于蛋白的 N 端 14-15。近年来， NEP 的翻译后修饰也 越来越被人们所重视，如包括 NEP 在 内的多种病毒蛋白都会受到细胞的类泛 素化修饰；NEP 可以通过磷酸化来调节 自身的功能等16-17 。 3 NEP 的生物特性 3.1 NEP 促进 vRNPs 的出核 如图 3 所示，促进 vRNPs 的出 核是 NEP 的主要生物功能。流感病毒 的 RNA 以 vRNPs 复合体的形式存在， vRNPs 复合体由病毒 RNA、NP 蛋白和 三种病毒聚合酶（PB1、 PB2 和 PA）共 同组成，vRNP 的分子量很大，不能直 接通过细胞核的核孔18 ，需要在 NEP、M1 和宿主蛋白的共同作用下运 输到胞质。类似于 NEP 的功能，首先 见于对 HIV-1 的 Rev 蛋白的研究， Rev 蛋白主要负责介导病毒 mRNA 的出核 19。Rev 蛋白上有 NES 序列19 ，它 能被出核受体蛋白 Crm1 蛋白 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 （chromosome region maintenance 1 protein）所识别 20。Crm1 蛋白属于 karyopherin-（Kap ）受体家族，是细 胞内最主要的出核受体蛋白，负责核质 之间的蛋白和 RNA 的转运，Crm1 蛋白 能特异地识别靶蛋白上的 NES 序列并 与其结合，由它负责转运的蛋白多达数 百种21。不过与 Rev 蛋白相比， NEP 的 NES 序列的发现经历了一个相对漫 长的过程，第一个序列被证明距第二个 序列被证明相差了十多年，NES1 序列 为 12ILLRMSKMQL21（A/PR8/34）4 ， NES2 序列为 31MIT QFESLKL40（A/PR8/34）15 ，这两个 NES 序列都位于蛋白的 N 端，NEP 通 过 N 端的 NES 序列与 Crm1 蛋白相结 合。HIV-1 的 mRNA 存在一段 Revresponseelement 序列可以和 Rev 蛋 白相结合，形成 Crm1-Rev-mRNA 三聚 体，HIV-1 的 mRNA 组成复合体从胞核 运输到胞质22 ，在胞质中合成病毒蛋 白。与 Rev 蛋白不同的是，NEP 运输 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 vRNPs 并不是直接和 vRNA 作用，这中 间还有 M1 蛋白的参与。M1 蛋白的 C 端可以直接和 vRNP 中的 NP 蛋白和 vRNA 相互作用22，N 端存在 NLS 序 列，101RKLKR105，在与 NEP 的结合 中起到关键作用，对其中的 4 个氨基酸 进行突变后会大大减弱与 NEP 的结合 力9。NEP 的 C 端除了与 M1 蛋白结 合外还存在 PB1 和 PB2 蛋白的结合位 点，NEP 与病毒聚合酶的作用增加了这 个复合体的稳定性，所以 vRNP-M1- NEP-Crm1 复合体并不是一个简单的串 联体23。当 vRNP-M1-NEP-Crm1 出核 复合体到达核周时，Crm1 蛋白可以和 核孔复合物上的多种核孔蛋白相互作用， 通过出核复合体和核孔蛋白的作用将 vRNP-M1-NEP 复合体从核质转移到胞 质，完成 vRNPs 的出核24-25。当然 要顺利完成 vRNPs 出核还需要其他细 胞因子的参与，如 RanGAP1、RanGTP、RanBP3 等26。 宿主蛋白 AIMP2 在 vRNPs 的出核过程 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 中与 NEP 也存在着相互作用，AIMP2 是一种肿瘤抑制因子，NEP 可以保护 AIMP2 逃避泛素介导的蛋白降解，而 AIMP2 又可使 M1 蛋白的泛素化修饰转 为类泛素化修饰，让 M1 蛋白变得更加 稳定27，NEP 通过与 AIMP2 的作用 保护了 M1 蛋白，促进了 vRNPs 的出核。 Hu 等28还发现 NEP 通过 NES1 序列 与 CHD3（Chromodomain helicase- DNA-binding protein 3）相互作用来促 进 vRNP 的出核。 S 着 NEP 相关研究 的逐渐进展，会有越来越多有关 vRNPs 出核的宿主因子被发现。 3.2 NEP 调节病毒的转录和复制 多个研究报道提示 NEP 也参与 病毒的转录和复制。NEP 除了在介导 vRNPs 出核中充当适配器的作用外，同 时也是病毒聚合酶辅因子。NEP 的 C 端存在着能与 PB1 和 PB2 蛋白结合的 位点，NEP 通过与 PB1 和 PB2 蛋白的 相互作用参与调节病毒的转录和复制 23。在人感染 H5N1 禽流感病毒中， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 NEP 第 16 位氨基酸变异（M16I） ，使 得禽流感病毒能适合人感染，提示 NEP 也参与禽流感跨种间传播和感染29。 禽流感病毒的某些基因（如 PB2- E627K）发生突变使得禽流感病毒在哺 乳动物细胞内也具有较高的复制能力， 从而打破种间屏障传播感染人类30。 Mnz 等 29发现存在一部分人源性 H5N1 流感病毒仍然保留了第 627 位的 谷氨酸（PB2-E627） ，而它的 NEP 一般 会有相应的适应性突变，如 M16I，突 变后的 NEP 能更有效地提高聚合酶活 性来补偿 PB2 蛋白，以此来满足 H5N1 流感病毒在哺乳动物细胞内进行复制的 要求。后面，Reuther 等31通过实验证 明突变（M16I）后的 NEP 的分子结构 更适合流感病毒在哺乳动物细胞内进行 复制。NEP 一般可以通过 N 端与 C 端 的相互作用形成一个折叠状态的分子， 并且这种分子内的折叠又与温度有关， 一般在较低温度下 NEP 更倾向于折叠 且折叠状态会更加稳定31。流感病毒 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 在人类的感染部位以上呼吸道为主，而 禽鸟以消化肠道为主，人类上呼吸道温 度较低（3234） ，而禽类消化道的 温度较高（3941） 。突变（M16I） 后的 NEP 在低温环境中更耐受，使得 不那么容易形成折叠状态。在未折叠的 状态下，蛋白的 C 端可以用来和 PB1、 PB2 蛋白相互作用，刺激病毒聚 合酶，提高病毒的复制能力，使得流感 病毒可以在哺乳动物细胞内进行复制， 破除种间屏障31 。不过 NEP 提高病毒 聚合酶活性的特性也不是绝对的，低浓 度的 NEP 虽然可以刺激病毒聚合酶的 活性，但高浓度的 NEP 也会反过来抑 制病毒的复制29-32 。对 NEP 功能的 研究还只是处于起步阶段，阐明 NEP 调节病毒转录和复制的机制还需要更多 的实验来证明。 3.3 NEP 参与病 毒的出芽 NEP 参与病毒出芽也是 NEP 的 主要功能之一33 。NEP 可以同宿主蛋 白相互作用来影响流感病毒的出芽。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 NEP 和细胞膜上 F1Fo-ATPase 的 亚基 存在着作用，而 F1Fo-ATPase 的 ATP 酶活性在流感病毒出芽的过程中起到了 很重要的作用33 。王朝霞等34 利用 反向遗传技术获得的 NEPE67SPR8 突变 病毒株在鸡胚增殖后，不论是病毒的效 价还是 HA 的表达量都有明显的提升。 另一个研究发现 PR8 毒株的 NEPK86R 突变同样可以加速病毒颗粒的形成，突 变后的 NEP 并不改变 vRNPs 的出核及 病毒的转录和复制35 ，其机制可能与 突变后的 NEP 与宿主的 F1Fo- ATPase、FoB 和 F1 这三个因子的相互 作用增强有关，从而促进了病毒颗粒的 形成。 3.4 NEP 参与细胞信号转导 流感病毒被发现与细胞内的多条 信号通路有关系，其中被研究的最多的 是 Raf/MEK/ERK 信号通路36-38。当 细胞感染流感病毒以后会激发细胞内的 Raf/MEK/ERK 信号通路， Raf/MEK/ERK 信号通路的激发会引起 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 很多效应，如 TNF- 的大量表达， TNF- 被认为是一种具有抗流感病毒作 用的细胞因子36 。流感病毒感染会激 发细胞内的 Raf/MEK/ERK 信号通路，