酒精依赖大鼠脑CREB信号通路及血浆应激激素水平变化的研究

分 类号 :UDC：南 京 医 科 大 学学 位论 文酒 精 依 赖 大 鼠 脑 CREB信 号 通 路及 血 浆 应 激 激 素 水 平 变 化 的 研 究_指导教师_ 袁 孝 如 教 授 南 京 医 科 大 学 生 理 学 系 肖 继 皋 教 授 南 京 医 科 大 学 药 学 院 申 请 学 位 级 别 博 士专 业 名 称 药 理 学论 文 提 交 日 期 2003年 5月论 文 答 辩 日 期 2003年 5月学 位 授 予 日 期 2003年 7月 _答 辩 委 员 会 主 席 _评 阅 人 _: _2003年 05月 15日目 录中 文 摘 要 1英 文 摘 要 .7 1 t15实 验 内 容实 验 一 :酒 精 依 赖 大 鼠 模 型 的 建 立 .20实 验 二 ： 慢 性 饮 酒 和 戒 断 对 大 鼠 伏 核 组 织 CREB信 号 通 路 的 影 响 ：纳 洛 酮 翻 转 作 用 31实 验 三 ： 慢 性 饮 酒 和 戒 断 对 皮 层 组 织 CREB信 号 通 路 的 影 响 ：氟 西 汀 治 疗 作 用 61实 验 四 ： 急 性 酒 精 作 用 大 鼠 伏 核 、 皮 层 磷 酸 化 CREB变 化 及 其调 控 的 研 究 87实 验 五 ： 酒 精 依 赖 大 鼠 戒 断 行 为 与 血 浆 ACTH、 皮 质 醇 含 量变 化 的 观 察 102J、 # .109参 考 文 献 .111It i射 122m ii123博 士 期 间 发 表 论 文 .146南 京 医 科 大 学 博 士 学 位 论 文酒 精 依 赖 大 鼠 脑 CREB信 号 通 路 及血 浆 应 激 激 素 水 平 变 化 的 研 究全 文 摘 要背 景 ： 在 临 床 上 ， 成 瘾 物 质 大 致 可 分 为 三 类 ： 阿 片 类 （ 如 Heroin, Morphine )、 精 神 刺 激 类 （ 如 Cocaine)和 酒 精 （ Ethanol)。 酒 精 作 为 最 易 获 得 的 成 癃 物 质 ， 以 惊 人 的 消 耗 量 流 传 于 全 人 类 ， 酒 精 中 毒 、 酒 精 滥 用 已 经 成 为 世 界 各 国 较 为 普 遍 的 社 会 问 题 。 有 研 究 提 示 酒 精 滥 用 、 酒 精 依 赖 不 仅 与 暴 力 犯 罪 、 交 通 事 故 、 高 离 婚 率 等 社 会 现 象 有 明 显 相 关 ， 而 且 酒 滥 用 、 酒 精 中 毒 导 致 的 心 理 、 躯 体 上 的 疾 病 亦 成 为 仅 次 于 心 血 管 疾 病 、 肿 瘤 ， 居 于 第 三 位 的 医 学 问 题 。 因 此 ， 研 究 酒 精 依 赖 的 分 子 生 物 学 机 制 具 有 重 要 的 医 学 和 社 会 学 意 义 。众 所 周 知 ， 酒 精 与 阿 片 及 精 神 兴 奋 药 如 可 卡 因 、 笨 丙 胺 等 有 相 似 的 作 用 ， 如 使 人 产 生 欣 快 感 、 出 现 耐 受 和 依 赖 以 及 长 期 服 用 后 停 止 饮 酒 有 某 些 戒 断 反 应 1-4。 连 续 大 量 饮 酒 会 使 机 体 在 生 理 及 行 为 方 面 对 酒 产 生 依 赖 性 ， 同 时 引 致 机 体 多 器 官 系 统 的 病 理 改 变 。 依 赖 性 的 产 生 与 生 理 耐 受 性 的 形 成 有 关 ， 而 身 体 依 赖 性 一 旦 形 成 ， 个 体 就 会 表 现 出 对 酒 的 渴 求 和 经 常 需 要 饮 酒 ， 以 避 免 戒 断 综 合 征 的 折 磨 以 及 其 它 不 良 体 验 。 因 此 ， 酒 依 赖 的 这 种 核 心 特 征 就 是 对 酒 的 强 烈 渴 求 ， 即 失 去 控 制 地 寻 酒 和 饮 酒 行 为 。 尽 管 三 类 成 瘾 物 质 具 有 不 同 的 分 子 结 构 ， 在 中 枢 的 起 始 作 用 和 受 体 系 统 选 择 性 有 所 不 同 ， 但 它 们 产 生 强 化 和 奖 赏 效 应 的 中 枢 神 经 通 路 大 致 相 同 ， 主 要 神 经 结 构 是 中 脑 -边 缘 多 巴 胺 奖 赏 系 统 ， 其 中 中 脑 被 盖 区 （ ventral tegument area, VTA )-腹 侧 纹 状 体 （ 伏 核 ， nucleus accumbens, NAcc )-额 叶 皮 层 (frontal cortex)是 成 瘾 性 药 物 引 起 奖 赏 效 应 的 最 后 公 共 通 路 9， 成 为 研 究 酒 精 成 瘾 的 重 要 脑 区 。南 京 医 科 大 学 博 士 学 位 论 文对 于 成 瘾 物 质 造 成 身 体 依 赖 及 其 机 制 的 研 究 已 有 长 足 的 进 展 ， 且 已 有 比 较 有 效 的 治 疗 方 法 ， 而 对 于 成 瘾 物 质 造 成 强 烈 药 物 渴 求 及 脱 瘾 后 的 高 度 复 吸 率 问 题 ， 至 今 尚 无 理 想 的 解 决 办 法 ， 因 而 成 为 临 床 上 预 防 和 治 疗 物 质 成 瘾 的 关 键 。 有 理 论 认 为 ， 此 种 神 经 生 理 功 能 紊 乱 反 映 了 慢 性 用 药 所 导 致 的 信 号 转 导 功 能 及 神 经 细 胞 基 因 表 达 方 面 适 应 性 改 变 ， 这 些 改 变 引 起 了 神 经 元 活 性 的 改 变 及 神 经 环 路 的 变 化 ， 最 终 导 致 动 物 行 为 的 改 变 来 自 阿 片 类 药 物 的 研 究 报 道 了 参 与 奖 赏 效 应 形 成 的 部 分 基 因 ， 其 中 最 引 人 注 目 的 是 作 为 转 录 调 节 因 子 的 cAMP反 应 元 件 结 合 蛋 白 （ cAMP response element binding protein, CREB )和 CRE-调 节 基 因 （ cAMP response element modulatory genes ) 1W9)。 在 酒 精 成 瘾 方 面 ， 过 去 的 大 量 研 究 （ 包 括 我 室 自 1990 至 今 的 研 究 大 多 集 中 在 酒 精 引 起 的 神 经 适 应 性 改 变 方 面 ， 例 如 研 究 酒 精 作 用 下 神 经 元 活 动 的 改 变 ， 脑 内 内 源 性 阿 片 肽 及 受 体 结 构 和 功 能 的 变 化 ， 与 脑 内 其 它 神 经 递 质 受 体 系 统 关 系 等 ， 而 对 酒 精 成 瘾 的 細 胞 分 子 机 制 ， 尤 其 是 对 脑 内 奖 赏 通 路 （ 伏 核 、 皮 层 ） CREB信 号 转 导 功 能 的 改 变 至 今 尚 不 清 楚 。成 瘾 物 质 对 内 分 泌 系 统 的 损 害 越 来 越 受 到 人 们 重 视 。 普 遍 认 为 内 分 泌 系 统 功 能 的 紊 乱 是 阿 片 类 药 物 依 赖 对 机 体 所 造 成 的 最 为 普 遍 及 严 重 的 损 害 ， 而 阿 片 成 瘾 时 的 戒 断 症 状 可 能 是 一 种 特 殊 的 应 激 反 应 ， 即 在 阿 片 耐 受 与 依 赖 形 成 过 程 中 ， 机 体 逐 渐 适 应 这 一 状 态 ， 并 逐 渐 产 生 了 一 种 对 抗 这 种 状 态 的 改 变 即 反 适 应 性 的 应 激 能 力 521。 作 为 成 瘾 物 质 之 一 的 酒 精 同 样 亦 影 响 到 内 分 泌 的 每 个 系 統 ， 但 有 关 酒 依 赖 与 机 体 应 激 关 系 的 研 究 尚 未 见 报 道 。目的：在 酒 精 依 赖 动 物 模 型 上 ， 研 究 与 酒 精 奖 赏 效 应 产 生 有 关 的 中 枢 结 构 （ 伏 核 、 皮 层 ） CREB信 号 转 导 通 路 的 改 变 及 戒 断 后 应 激 行 为 、 应 激 激 素 水 平 的 变 化 ， 分 析 伏 核 /皮 层 CREB表 达 调 控 在 酒 依 赖 形 成 中 的 作 用 及 戒 断 后 机 体 应 激 反 应 与 酒 躯 体 依 赖 形 成 的 关 系 ， 以 阐 明 酒 依 赖 形 成 的 部 分 分 子 机 制 ， 为 预 防 和 治 疗 物 质 成 瘾 的 新 药 研 制 提 供 理 论 依 据 。方 法 :(1)给 大 鼠 饮 含 低 浓 度 乙 醇 （ 6% v/v)的 水 溶 液 28 d，2南 京 医 科大 学 博 士学 位 论 文建 立 酒依 赖 动物 模 型， 对 照组 饮 自来 水 。采 用 开场 方 法测 定 大鼠 饮 酒 期 间动 机 活性 变 化； 参 照 Erden等 2Q方 法观 察 大鼠 撤 除酒 精 后的 戒 断 综合 征 ；强 迫 游泳 （ 水温 18-21C)实验 检 测大 鼠 撤除 酒 精后 的 抑 郁症 状 ，以 评 定酒 依 赖大 鼠 模型 。 （ 2)采 用 免疫 组 织化 学 的方 法 检 测 大鼠 伏 核 /皮 层 组织 内 CREB、 鱗酸 化 CREB ( phosphorylated CREB, p-CREB )的 蛋 白表 达 ，Western blot检 测胞 核 、胞 浆 内上 游 激 酶Ca2 钙调 蛋 白激 酶 （CaMKIV)含 量 ，RT-PCR法检 测 伏核 / 皮 层 组织 内 脑源 性 神经 营 养因 子 （ brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基 因 表达 ， 以分 析 酒依 赖 过程 中 CREB表 达调 控 的变 化 。（ 3) 采 用 放射 免 疫分 析 法检 测 血浆 中 ACTH、 皮质 醇 水平 ， 采用 冷 水强 迫 游 泳 （ 5 C冷 水） 实 验观 察 饮酒 大 鼠戒 断 后的 应 激反 应 。结果：（1 )大 鼠 连续 饮 用低 浓 度酒 精 28 d,其 动机 活 动出 现 一 适 应 性变 化 过程 ， 即在 饮 酒第 7、 14 d,饮 酒大 鼠 水平 动 机活 动 （爬 格 数 ）和 探 究行 为 （站 立 次数 ） 均降 低 ，与 对 照组 比 较 PJ/3)3J5UI0U03一(DAlfeQ24南 京 医 科 大 学 博 士 学 位论 文 EthanolControl0 12 3 4Time( weeks)图 1-2 4周 内 对 照 大 鼠 和 饮 酒 大 鼠 体 重 变 化Fig. 1-2 Weight pronles in ethanol-treated and control rats over 4-week feeding food.2慢 性 饮 酒 过 程 和 停 饮 后 血 中 酒 精 浓 度 变 化饮 酒 组 大 鼠 在 整 个 饮 酒 过 程 中 ， 血 液 中 酒 精 浓 度 变 化 不 大 ， 均 在 0. 085mg/ml以 下 ， 各 组 动 物 血 液 中 酒 精 浓 度 也 未 见 明 显 差 异 。3慢 性 饮 酒 过 程 大 鼠 动 机 行 为 变 化本 实 验 采 用 开 场 方 法 观 察 了 在 饮 酒 7、 14、 21、 28 d酒 精 处 理 组 及 对 照 组 大 鼠 对 新 环 境 的 反 应 ， 結 果 见 图 1-3。 慢 性 饮 酒 可 导 致 水 平 动 机 活 动 （ horizontal locomotor activity,爬 格 数 ） 显 著 减 少 ， 在 饮 酒 第 7 d减 少 最 明 显 ， 与 对 照 组 相 比 减 少 64%( P 0.05, 见 图 1-4。- -对 照 组 -饮 酒 组2h6h2h5O22O27南 京 医 科 大 学 博 士 学 位论 文5慢 性 饮 酒 及 戒 断 后 大 鼠 抑 郁 行 为 的 变 化采 用 强 迫 游 泳 实 验 ， 观 察 大 鼠 连 续 饮 酒 28 d后 撤 除 酒 精 对 大 鼠 绝 对 不 动 时 间 的 影 响 （ 图 1-5)， 以 检 测 酒 精 戒 断 大 鼠 的 抑 郁 症 状 。 結 果 发 现 饮 酒 大 鼠 （ 戒 断 0 h)在 强 迫 游 泳 实 验 中 的 绝 对 不 动 时 间 与 对 照 大 鼠 接 近 ， 而 戒 断 24 h时 ， 大 鼠 游 泳 时 绝 对 不 动 时 间 延 长 ， 与 对 照 组 比 较 P 0. 001,图 1-5;在 戒 断 48 h,其 游 泳 时 绝 对 不 动 时 间 与 对 照 组 比 较 仍 延 长 ， 至 戒 断 72 h大 鼠 绝 对 不 动 时 间 虽 有 所 缩 短 ， 但 与 对 照 组 相 比 较 仍 延 长 （ P 0. 05,图 1-5 )。 以 上 结 果 提 示 连 续 饮 酒 28 d的 大 鼠 撤 除 酒 精 后 24-72 h出 现 严 重 的 抑 郁 症 状 。24 h 48 h 72 h图 1-5酒 精 处 理 大 鼠 戒 断 期 间 绝 对