荧光定量pcr技术讲座20110525xyy

实时荧光定量 PCR(Real time Quantitative PCR)北京康为世纪生物科技有限公司Real time Quantitative PCRPCR：伟大的天才发明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrologyPCR：理想与现实起点定量终点定量 起点定量检测 ： - 起点量是样本中未经 PCR放大之前的模板量- 具有重现性，误差小- “加入了 500个拷贝 ” 终点定量检测 ：- 终点产物量经过 PCR放大的 DNA量- 不恒定，误差大- “生成了 500， 0000， 0000个拷贝 ”确定模板初始数量real-time使 qPCR成为可能起始模板量 Ct值指数扩增期 平台期Real-time PCR: 检测原理非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记：水解探针： TaqMan非水解探针： Molecular beaconRQReporterQuencherR Q535 3 SG SGSGSG535 3SG SG SG SGEmission Excitationl SYBR Green I 是一种与双链 DNA小沟结合的荧光染料。l SYBR Green I只与双链 DNA结合才能发出荧光。l 荧光信号的强度与反应体系中所有双链 DNA分子成正比。SYBR Green I 工作原理Taqman 工作原理在退火过程中，探针与靶序列结合探针被 Taq酶的 5- 3 外切酶活性剪切成片断 游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离荧光信号强度与结合探针的 DNA分子成正比。染料法与探针法 对比探针法 特异性高- 与探针与特异靶序列结合 对模板有选择性- 可进行多重 PCR反应 成本高- 不同靶基因需要合成不同探针染料法 通用性好- 对 DNA模板没有选择性 使用方便，成本低- 仅需设计两个引物 有假阳性现象- 通过融解曲线判断Real-time PCR 应用 基因表达分析- 相对定量： 基因表达量的差异- 绝对定量： 样本中核酸的量（拷贝数、微克） 基因型分析- SNP检测 等位基因检测 甲基化检测基因表达分析检测test sample处理样本target gene目的基因reference gene内参基因total RNAcDNAtotal RNAcDNAcalibrator sample对照样本target gene目的基因reference gene内参基因qPCR qPCR以各自样本中内参基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度。数据分析基因表达分析检测 内参基因 (housekeeping gene)选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR内参基因的选择特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、 18S rRNA、28S rRNA等- 文献检索- 实验筛选选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准内参基因Housekeeping Gene- RNA抽提、反转录为 cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。对样本初始浓度差异进行均一化校正。不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。Housekeeping Gene 康为产品不同丰度：高丰度 ACTB、 GAPDH中等丰度 beta2M低丰度 HPRT1不同物种：人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等基因表达分析检测 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR 内参基因 (housekeeping gene)选择样本处理与 RNA提取 外界刺激 10分钟 可检测的表达改变 样品离开定义环境 2分钟内 固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯 RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定- 完整性- 纯度 小心 DNA污染！ - 使用 DNase- 引物设计- 以 RNA作 PCR阴性对照CW0580CW0592CW0581CW2090ART-qPCR一步法还是两步法？两步法： 步骤多但灵活多样。 cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。一步法： 简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。逆转录逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰： mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？逆转录酶 SuperRT 逆转录酶（ RNase H-） HiFi-MMLV逆转录酶（ RNase H-）引物 特异性 反应效率Oligo dT 中 低Random hexmer 低 中Specific primer 高 高CW0741CW0743总原则与普通 PCR相同：l 避免引物二聚体，避免二级结构l 扩增片段长度（ 80 300 bp)l 推荐做跨 intron设计引物设计原则EXON 1 EXON 2INTRON 2 DNAEXON 1 EXON 2 RNA反应条件优化内参基因 目的基因 - 扩增曲线： Ct值- 融解曲线： 单一特异性产物- 标准曲线：扩增效率尽量高，目的基因尽可能接近内参基因反应条件优化扩增曲线分析- Ct值反应条件优化融解曲线分析- 单一特异性产物将温度对荧光强度的变化求导图 2 Effciency slope内参基因 100% -3.32目的基因Primer 278% -4.00图 1 Effciency slope内参基因 100% -3.32目的基因Primer 195.36% -3.43标准曲线分析 - 扩增效率尽量高- 目的基因尽可能接近内参基因10%以内反应条件优化Master Mix的应用- 热启动酶 化学修饰， 常温下完全没有聚合酶活性，热复活需 95 10分钟 - GoldStar、 HotStar 非化学修饰 （ Oligo修饰、抗体修饰、 Mg2+螯合物）热复活仅需 95 几十秒 -FastStar- Buffer 反应增强剂- 减少引物二聚体，进一步提高反应特异性- 对于复杂模板，提高反应效率 稳定剂- dNTPMaster Mix的应用ROX Passive Reference 不参与、不干扰 PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 需参照仪器要求选择。误差控制 使用 Master mix 配置预混体系 设置生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔） 阴性对照荧光定量 PCR体系2- Ct法满足条件： 1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 -正负 10%2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为 90%-110%相对定量数据分析1、目标基因的 CT值 -内参基因的 CT值2、待测样本的 CT 值 -对照样本的 CT 值3、计算表达水平比率： 2 CT =表达量的比值2-Ct 法 目的基因 内参基因目的基因-内参基因 Ct待测样本-对照样本 Ct倍数值fold2-Ct对照样本 30.485 23.625 6.86 0 1待测样本 27.025 22.66 4.365 -2.495 5.63728Trouble shooting常常 见问题见问题 可能原因可能原因 解决方法解决方法Housekeeping gene无信号RNA降解 用新 鲜组织 提取 RNAHousekeeping gene 有信号而目 标 基因无信号1. 目的基因表达低。逆 转录 效率不高2. PCR引物不良1. 富集 mRNA 2. 在逆 转录 中 尝试 不同引物，如特异引物。3. 尝试 不同 PCR引物。减小 产 物大小，改 换 目 标区段，考 虑 不同剪接体。4. 尝试 不同 热 循程序，降低复性温度。Housekeeping gene反 应 效率正常 ,但目 标 基因放大效率不高PCR引物不良 重新 设计 引物，减小 产 物大小，改 换 目 标 区段，考 虑 不同剪接体目 标 基因表达丰度在样 本之 间 异常一致RNA被基因 组 DNA污 染 1. 使用跨 intron 引物 用 DNase处 理 RNA 确保 RNA阴性 对 照表 现 阴性溶解曲 线 出 现杂 峰 1. 出 现 非特异 PCR产 物 出 现 引物二聚体1. 尝试 不同 PCR引物 尝试 不同 热 循程序，升高复性温度 修改 仪 器 设 置，将 检测 温度 设 定在在引物二聚体解 链 温度与 PCR特异 产 物解 链 温度之 间 。阴性 对 照在 30个循 环以内出 现 信号试剂 被 污 染 1. 注意区分信号是来自引物二聚体 还 是 PCR产 物查 找，替 换污 染 试剂2. 使用 UNG系 统 。荧光定量产品 -染料法FastSYBRMixtureUltraSYBRMixturelGoldStar Taql特异性强l灵敏度高lCt值更低l线性范围更广l定量更准确l反应速度快l比普通反应可节省约 40分钟l适合于普通和快速定量 PCR程序荧光定量产品 -染料法某其它品牌 康为 UltraSYBR- cDNA用内参 actin引物进行扩增，产物片段 100bp。- 模板浓度进行 10倍稀释，稀释 6个梯度。 康为世纪产品RNA- Trizol -超纯 RNA提取试剂盒- 动物组织 RNA - 植物 RNA - 血液 RNA - 病毒 RNA 逆转录-Su