提取中药金银花中有效成分的研究

1微波帮助提取金银花中有效成分的研究郭振库 *11 金钦汉 1 范国强 2 段豫平 2 秦晨 2(1. 吉林大学化学系，长春 130023；2. 北京同仁堂集团公司技术中心，100011)摘 要： 应用国产具有压力控制附件的 MSP-100D 专用微波制样系统，进行金银花中有效成分氯原酸和异氯原酸类化合物的微波提取研究。微波提取的溶剂选择、溶剂体积对样品质量比、加热的溶剂压力和微波辐射时间，用正交实验设计进行了考察。通过对实验结果的分析，综合经济因素和实验过程的方便性，在 70% 微波功率（微波炉的最大功率 850 瓦）下，微波最佳提取条件为 30%乙醇作溶剂，溶剂倍量 30，控制压力 0.10Mpa，加 热时间 1 分钟。在微波帮助提取和超声波提取方法的最佳提取条件下，比较了用微波法和超声波的提取率和重复性。结果表明，微波法提取不仅所需时间短，而且提取率比超声波法高近二成。关键词：微波提取；正交实验；金银花；氯原酸1 介绍金银花是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thumb）的干燥花蕾。几千年传统实践及近代药理实验和临床应用都证明金银花对多种致病菌有较强的抗菌作用和较好的治疗效果。金银 花抗菌的主要有效成分是金银花中所含的异黄酮类化合物氯原酸和异氯原酸等 1。微波是频率在 300-300,000MHz（波长 1mm-100cm）的电磁波，由于微波对介质有一定的穿透深度（相对于传导加热），因此，物体可以里外同时受到照射， 实现快速加热。微波加热技术在化学中的应用最为普及的是微波制样技术 2-4。用微波消解样品进行元素分析的方法已成为美国的一些 EPA 标准方法，在我国也正逐渐被有关部门所接受，目前已有一些食品、化妆品等样品的微波消解方法通过国家标准审定， 颁布为样品分析的 标准方法。微波帮助萃取技术在提取植物油方面的研究成果已有多项专利授权 5，并已有专用的设备上市 6。在中草药现代研究中，快速提取并提高有效成分的提取率是我国中药研究的重要前沿课题。这方面，超临1 联系人：郭振库，北京方庄群园 1-1-811，100078，email:2界提取和微波帮助提取已受到有关专家们的重视。已有应用微波帮助提取中药重楼中的重楼皂甙 7和高山红景天中的高山红景天苷 8的报导。他们的结果表明，微波法提取所得产品具有杂质含量低、有效成分高，且提取时间短的优点。本文 则应用具有压力控制附件的专用微波制样系统，对金银花中有效成分氯原酸和异氯原酸类化合物的微波提取条件，用正交实验设计进行了考察，并比较了用微波帮助提取和超声波提取方法的提取率和重复性。结果表明，微波法提取不仅所需时间短，而且提取率比超声波法高近二成。2 实验2.1 仪器MSP-100D 具有压力控制部件的微波样品制备系统，设计压力可按0.01MPa调节，具有一秒时基设置，最大功率 850 瓦，微波功率 1-100%可调（北京雷明科技有限公司）UV-365，UV-VIS-NIR 分光光度计（日本 岛津）CX-250 超声波清洗器（北京医疗设备二厂）2.2 试剂和材料70%医用酒精氯原酸标准品（中国药品生物制品检定所）金银花药材（北京市售饮片）2.3 提取和测定方法微波法提取：准确称取 0.5g 磨成粉末的金银花样品(粒度 1-2mm)，置于特制的 PFA（一种特殊的耐化学腐蚀且可承受 200高温的氟塑料）内杯中。根据实验要求加入选取的提取溶剂，并确保溶剂完全淹没样品，漂浮在溶剂液面上的一些较轻的样品颗粒不会影响样品制备，但粘附在 PFA 内杯内壁上的样品颗粒或粉末，在加溶剂时一定要冲洗到杯内的溶剂中。根据微波制样要求，把内杯放入到制样罐中后，要确保内杯盖密闭，并在安全防爆孔中放入一片安全膜后拧上压盖，用于压力控制的样品罐上不放安全膜。将全部样品罐放入微波制样系统中时，控制罐的安全孔接压力传感器接头。按照3不同的加热时间、微波功率、压力条件和恒压时间，设置好微波处理程序后，开动微波制样系统开始样品处理。微波加热处理结束后，待制样罐内温度降到溶剂沸点以下时（此时可从仪器条件显示窗上观察压力值， 压力值为“0”或接近“0”即可），取出制样罐。打开制样罐后，用同样的溶剂清洗内杯盖，并把清洗液一起置于内杯中，然后把样品通过漏斗转移到 50mL 容量瓶中，用同样的溶剂定容至刻度。超声波提取方法：准确称取 0.5g 粉末样品，置于 50mL 容量瓶中，加 30mL 溶剂，把几个容量瓶放到一个有一定量水的大烧杯中，烧杯内水量以使容量瓶不漂起为宜，然后把放有容量瓶的烧杯放到装有定量水的超声波清洗器中，超声清洗池中的水深以不致使烧杯漂起为好。样品经超声波处理 30min 后取出，用同样的溶剂定容。样品中的氯原酸及氯原酸等黄酮类化合物于 330nm 波长处进行分光光度法测定。由于 0.5g 样品处理后定容于 50mL 容量瓶中，其氯原酸等浓度均高于紫外分光光度计的测量上限，因此，每个样品均需用 30%乙醇稀释后进行测定。配制好的含氯原酸 0.30mg/mL 的标样，用 30%乙醇配制成 15ppm 的标准溶液，以 30%乙醇作空白， 测 出其相应的吸光度值。 样品中氯原酸类化合物的百分比浓度用下式计算而得：A 样 C 标 V 样P 百分 = 100% （1）A 标 W 样（1）式中 P 百分 为样品在不同 处理条件下测得的氯原酸类化合物的百分含量A 样 样品的吸光度值A 标 标准溶液的吸光度值C 标 标 准溶液中氯原酸的浓度（g/mL）V 样 样品稀释体积（mL）W 样 样品的 实际质量（g ）3 结果与讨论3.1 样品上清液中杂质对氯原酸类化合物紫外吸收测定的影响为弄清定容后样品上清液中是否有会影响氯原酸紫外吸收测定的悬浮杂质，各取上清液 10mL 2 份，一份在 5000 转/分的离心机上离心处理 6 分钟，另一份不4作离心处理。离心后的样品清液与未经离心处理的样品清液，分别在同样条件下进行紫外吸光测定，结果表明，二者之间的吸光度值没有差异。3.2 不同方法处理后的氯原酸类化合物稳定性考察为了考查微波提取出的氯原酸类化合物的稳定性，取 6 份样品，其中 2 份用超声法处理 30min，另外取 2 份用微波在 0.05Mpa 下处理 1min，其余 2 份，在0.05Mpa 下用微波处理 2min。样品定容至 50mL 后，取上清液各 0.5mL 再定容到20mL 比色管中，在 330nm 处测定吸光度值， 过约 24h 后，重新测定。定容在50mL 中的 样品在过约 24h 后，取 0.5mL 定容到 20mL 比色管中，然后进行测定。其氯原酸类化合物的测定值列于表 1。表 1：氯原酸类化合物稳定性考察Tab.1 Examination of the stability on the compounds such as Chlorogenic acid方法 处理时间（分钟）氯原酸类化合物含量（%）提取液含量（%）d原浸液含量（%）e超声法 30 5.85 -0.32 +0.32超声法 30 5.857 -0.43 +0.16微波法 a 2b 5.893 -0.29 +0.31微波法 a 2b 5.792 -0.30 +1.91微波法 a 1c 5.555 -0.32 +1.84微波法 a 1c 5.654 -0.32 +2.14a:微波功率 500W，压力 0.05Mpa；b：按秒计，2 分=120 秒；c：按秒计，1 分=60 秒；d：提取液指取出的上清液放置 24h，“-”表明 测定值降低的百分值。e：原浸液指样品溶液与样品在一起放置 24h，“+”表明测定值增加的百分值。考虑到经微波处理的样品，放置 24h 后，所浸出的 氯原酸类化合物有增加的趋势，且有的增加值还比较 大，因此，应尽量做到当天 处理的样品，当天测定。3.3 正交实验考察微波提取中不同条件的影响根据微波提取葛根中葛根素的实验结果 9，已知样品颗粒在 1-2mm 时，微波提取结果基本一致，因此，本实验中，金银花样品，直接粉碎至 1-2mm 粒度后用5于实验。实验中选取不同乙醇含量（%）的溶剂、溶 剂 倍量、微波 处理时间和微波处理压力四个因素，每个因素取 3 个水平，因素和水平列于表 2 内。表 2 因素水平表Tab.2 The factors and levels for the orthogonal design因素水平A/乙醇含量（%）A/Ethanol concentrationB/溶剂 倍量B/Times of solventC/处 理时间（秒）C/Time(s)D/压力（MPa）D/Pressure(Mpa)1 0 20 30 0.052 30 30 60 0.103 60 40 120 0.15不同因素 A 是蒸馏水中含不同量乙醇的溶剂，B 是相对于 0.5 克样品的溶剂倍量(V/W)， C 是微波到达控制目标压力下的保持时间 （以秒计）， D 是微波提取时实验需要的罐内压力(Mpa) （该值也间接反映了罐内温度值）。考虑到各因素间可能产生交互作用，正交表的设计选择 L27（313）正交表。表 3 表头设计Tab.3 Design of orthogonal test因素factorA B C AC D AD CD E F G列号Raw No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13以前的微波提取葛根中葛根素的实验表明，溶剂倍量在 5-50 时，提取产率相差不大，因此，本实验中未对溶剂倍量与其他因素的交互作用加以考虑。金银花中氯原酸类化合物含量的测定。本实验中采用超声波提取 30 分钟的结果作为本批金银花中氯原酸类化合物的真实含量，因为根据有关研究报导10，在用超声波处理 30 分钟后，其提取率已几乎达到 100%。本实验中，同批金 银花中氯原酸类化合物用超声波提取法的含量为 5.854%。不同条件下金银花中氯原酸类化合物提取率的测定。称取 0.5 克金银花样品，6根据 L27（313）正交表，按控制 压力条件相同且其他条件不同的实验号为一批进行实验，每个实验号进行一次实验，每天 处理的样品都在当天完成提取率测定，所得结果见表 4。表 4 不同微波条件下提取金银花中氯原酸类化合物的产率Tab.4 Yields of the compounds such as Chlorogenic acid leached from Flos Lonicerae with different microwave conditions试验号Test No.氯原酸类化合物含量（%）Content of compounds提取率（% ）Leached percent1 4.845 82.762 4.705 80.373 5.304 90.604 4.574 78.135 5.214 89.076 5.090 86.957 5.373 91.788 5.112 87.329 4.909 83.8610 5.685 97.1111 5.406 92.3512 5.317 90.8313 5.391 92.0914 5.990 102.315 5.771 98.5816 5.294 90.4317 5.298 90.5018 5.832 99.6219 4.992 85.2820 5.384 91.9721 5.671 96.8722 5.822 99.4523 5.766 98.5024 5.592 95.5225 5.628 96.1426 5.929 101.327 5.790 98.917由表 4 计算：27 个实验测定值，氯原酸类化合物含量（%）的总和为； yi=145.68827 个实验测定值，氯原酸类化合物含量（%）的平方和为；yi2=789.9027 个实验测定值，氯原酸类化合物含量（%）和平方的平均值为；CT=1/27( yi)2=786.1127 个实验测定值，氯原酸类化合物含量（%）的总离均差平方和是；SS 总 =yi2-CT=789.90-786.11=3.7927 个实验测定值， 其总自由度为： f 总 =27-1=26试验结果的方差分析：表 4 实验结果的总离均差平方和为 3.79。各因素及误差的离均差平方和列于表 5。表 5 各因素及其交互作用和误差的离均差平方和Tab.5 The standard deviation of the different factors and the average standard deviationA B C AC D AD CD E F G因素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13离均差平方和2.007 0.175 0.187 0.024 0.166 0.426 0.077 0.029 0.202 10.93 0.141 0.426 0.141平均离均差平方和2.007 0.175 0.187 0.095 0.095 0.426 0.053 0.053 5.567 5.567 0.236 0.236 0.236由表 5 可见，实验误差引起的平均离均差平方和为 0.236，各因素离均差平方和大于误差离均差平方和的有 A、D 和 CD，这表明， 对实验起影响作用的主要是 A、D 和 CD。根据方差分析 计算要求，其他离均差平方和可并入误差总离均差平方和的因素有 B、C 和 AC，AD。合并后误差的总自由度 f 误差 和总离均差平方和 SS 误差 为：f 误差 =fB+fC+fA*C+fA*D+fE=2+2+22+22+23=18SS 误差 =SSB+SSC+SSA*C+SSA*D+SSE=0.175+0.187+0.0952+0.0532+0.2362=1.3668对实验结果有影响因素的显著性列于表 6。表 6 显著性检验表Tab.6 Remarkable examination of the different factors方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 值 显著性 A 2.007 2 1.004 13.21 *D 0.426 2 0.213 2.80 *CD1 0.202 2 0.101 1.33CD2 10.932 2 5.466 71.92 *误差 1.366 18 0.076显著性检验的临界值 F0.10（2，18）=2.62根据显著性检验表可知，溶剂中乙醇的含量影响提取率，且实验结果表明醇含量高时，提取率高，但从 30%乙醇到 70%乙醇，提取率增加较少，从成本角度考虑，用 30%乙醇的溶剂进行提取，已可取得 满意的 结果。此外，从 实验中观察到，当纯水作溶剂时，有一些样 品颗粒漂浮在溶剂的液面上，且在较短的加热时间（30秒内）结束后，仍有一些样 品颗粒漂浮在处理后的溶液液面上，用水定容后， 这些漂浮的颗粒长时间漂浮，不 仅影响样品的转移，而且影响溶剂有效地浸取待测成分。分析原因，我们认为，用 纯水作溶剂时，由于水的密度大，一些大的样品颗粒不容易吸收水而沉到溶剂中，因此，短的加热时间，不容易使样品颗粒被完全浸没。但当提取压力增加或加 热时间长时，水可完全浸没样品颗粒，从而 获得好的有效成分提取率。用含乙醇的溶剂提取时，由于溶 剂 密度小， 样品更容易沉没到溶剂中，因而有利于金银花中有效成分的提取。因素 C 和 D 是微波处理的时间和压力条件，表 6 表明微波加热压力和时间的相互作用对提取率的影响最大。表 7 列出了 C 和 D 相互作用下最好提取结果的条件。表 7 微波处理时间和压力对金银花中氯原酸提取率的影响Tab.7 Effect of the microwave radiating time and solvent pressure/temperature on the yield of the compounds such as chlorogenic acid leached9因素 D1 D2 D3C1 15.86/3 16.88/3 14.87/3C2 15.90/3 16.62/3 16.28/3C3 15.82/3 16.59/3 16.87/3由表 7 可知，C 1D2 条件下，提取率最高（即在 0.10MPa 压力下，加热 30 秒钟）。通过实验结果分析，综合经济因素和实验过程的方便性，我们选取 A2B2C2D2 作为最佳实验条件，即溶剂选取 30%乙醇，溶 剂倍量 30，加 热时间 1 分钟，控制压力0.10MPa3.4 微波法和超声波法提取时提取率和平行性的比较用正交实验后选取的最佳微波提取条件和用实验室常规应用的超声波提取方法，对 同一批样品，用相同的溶剂，进行了两种提取方法 对金银花中氯原酸类化合物成分的提取收率和平行性的比较，结果见表 8。表 8 超声波和微波法提取金银花中氯原酸类化合物的结果比较Tab.8 Comparison of the results between supersonic and microwave extraction 方法 Method 超声波提取 a Supersonic 微波法提取 b Microwave6.128 6.150 6.159氯原酸类化合物（ %）4.7715.0325.7265.3464.8735.226 6.082 6.826平行数 6 5可疑值 4.771 6.826可疑值取舍 Q 值 =0.107Q90%（6）=0.56 取 Q 值 =0.896Q90%（5）=0.64 舍平均得率（%） 5.162 6.122标准偏差 0.349 0.036CV（%） 6.76 0.59由表 8 可知，对于金银花中氯原酸类化合物的提