五味子花粉提取工艺的研究

广州中医药大学中药学院本科毕业论文（设计）开 题 报 告题目： 五倍子花粉多糖最佳提取工艺研究年级专业 07 中药学（营销与物流方向）学 号 2007031304姓 名 邱天龙指导教师 王利国教师单位 广州中医药大学药用植物学教研室填表日期 2011 年 2 月 21 日中药学院本科毕业论文（设计）开题报告学生姓名邱天龙 学号 2007031304 年级专业 2007 级 中药学（营销与物流方向）专业指导老师王利国 学历职称 博士讲师 工作单位 广州中医药大学药用植物教研室论文题目五倍子花粉多糖最佳提取工艺研究选题依据与研究意义：保健用的花粉是从显花植物中采集的花粉粒，除此之外还可能混合植物自身特殊腺体分泌物，花粉中含有植物的两个雄性配子，它不仅携带着生命的遗传信息，而且包含着孕育新生命所必需的全部营养物质，是植物传宗接代的根本，热能的源泉。是植物生命的微型营养库，国际公认极好的营养品。 1据资料，花粉起保健作用的营养成分主要是花粉多糖、超氧化歧化酶（SOD） 、维生素 E、生物碱、黄酮类等。 五 味 子 是 多 年 生 落 叶 藤 本 ， 属 木兰科，可作药用，为木兰科植物五味子习称“北五味子”，或华中五味子，习称 “南五味子”的干燥成熟果实。功效收敛固涩，益气生津，补肾宁心等。 2花粉多糖是从花粉中提取出来的一种糖蛋白，与花粉的保健或药用功效密不可分。现在关于多糖的研究较多，但有关花粉多糖的研究较少，关于五味子花粉多糖提取工艺的研究就更少。文献综述（结合阅读的参考文献，概述国内外研究现状及发展趋势，要求不少于 1200 字）：(一)多糖提取方法的研究进展 31.传统提取方法:五味子花粉多糖的提取可采用水提醇沉法，得到粗多糖，然后进行脱蛋白和纯化处理，李道荣（2002）以香蒲花粉多糖为材料，研究得到香蒲花粉多糖的最佳提取条件为提取温度70摄氏度，提取时间为4h，加水比为1:7，不同类的多糖对最佳提取温度，溶剂，时间等因素有影响，需按照情况选取不同的最佳提取工艺。2.微生物法:使用微生物法提取分离花粉多糖，由于微生物会对花粉造成污染，且会产生新物质及需要耗用花粉中的营养物质，所以一般不常用微生物法来提取花粉多糖。3.酶法提取:利用酶分解细胞壁，可令到细胞壁被破坏，提高得率。复合酶多采用纤维素酶、果胶酶及中性蛋白酶。李道荣（2002）研究发现，酶法破壁的香蒲花粉比未破壁的香蒲花粉，用水提醇沉法提取花粉多糖，提取率提高66.034.超声波法:超声波法对多糖的强化提取过程无化学反应，被浸提液生物活性保持不变，是一个物理过程，可提高花粉多糖的提取效率。杜晓平等（2007）以超声功率400 W，超声时间10 min，浸提温度80 ，并采用Sevag法除3次蛋白质以纯化多糖，得率为18.54 mg/g，比直接热水提取法提高了2.02倍。 4(二)花粉多糖纯化方法研究进展中药包括一般的草药在内,已达 5000 余种,而常用的约有 700800 种,其中绝大部分为植物药。中药历来就被公认为既有益于健康又有特定治疗效果,利用具有悠久食用历史的中草药作为食品防腐剂具有低毒、 更 容 易 为 消 费 者 接 受 的 优 点 。1996 年 日 本 批 准 使 用 的 天 然 食 品 添 加 剂 中 有 很 多 是 中 药 的 提 取 物 ,如 当 归 提 取液 、 连 翘 提 取 物 等 ,而 它 们 又 大 多 作 为 防 腐 保 鲜 剂 使 用 。 可 见 中 草 药 以 其 天 然 的药 用 价 值 成 为 天 然 防 腐 剂 的 理 想 来 源 。 因 此 ,探索抑制黄曲霉生长的中药有效成分研究对于大力开发有潜力的中药,寻找天然生物防腐剂有一定的意义。谢小梅,许杨,方建茹 8用中药活性成分肉桂醛、柠檬醛研究抑制黄曲霉细胞DNA、RNA的影响,发现其抑制黄曲霉的效果很好。罗仁夏,林如涛等 9通过茵陈蒿水煎剂对致癌剂AFB 1诱导TA 90移码型、TA 101碱基置换型突变株回复突变抑制实验,发现茵陈蒿对AFB 1的致突变作用有显著抑制效果、并呈剂量效应关系。刘世会,赵德刚10用纸片琼脂扩散法,研究了杜仲抗真菌肽EAFP3对黄曲霉的抗真菌活性,结果表明, EAFP3对黄曲霉有明显抑制作用。余伯良 11采用平板法比较天然增香剂山苍子油与合成食用防腐剂苯甲酸钠、山聚酸钾对8种霉菌的抗菌效力,结果表明，在培养基pH4.5时山苍子油对多数霉菌的最低抑菌浓度为1.77mg/ml,与山梨酸钾的抑菌强度相近，比苯甲酸钠强；但当培养基PH5.5以上时苯甲酸钠对霉菌几乎无效，山梨酸钾的抗菌效力也有减弱，而山苍子油受影响很小，其活性pH范围为4.58.5。蒋红梅,方 俊等 12采用杯碟法测抑菌圈，参考Victor方法测最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，平板法计数黄曲霉孢子萌发，显微镜观察石香薷提取物作用后的黄曲霉的形态,结果表明石香薷提取物抑制黄曲霉MIC为0.15mg/mL，MBC为0.20mg/mL,石香薷提取物对黄曲霉孢子萌发有显著的抑制作用，可使黄曲霉菌丝、足细胞、孢子梗的形态发生明显改变。刘方,吴子斌等13测定了三种不同植物的核糖体抑制蛋白(RIPs)- Momordin、Luffin和Saporin的抗真菌活性,结果显示，Momordin有最强的抗黄曲霉活性,Luffin次之，而Saporin对黄曲霉的生长无影响,所以同一真菌对不同核糖体抑制蛋白的敏感程度不同。(三)中药材抑真菌活性成分天然产物中的很多萜类化合物都具有较强的抗真菌活性，在抗真菌剂的寻找中应引起足够的重视。樟科植物挥发油成分均具有一定的抗真菌作用，甚至有些具有较强的活性。很多萜类成分具有较强的抗真菌活性，而且对深部和浅部真菌都有作用，因此萜类化合物的抗真菌活性值得深入研究。此外对皂苷类和黄酮类的研究也较多，有些成分也具有较强的抗真菌活性,如肉豆蔻属植物Myristica cinnamomea果实中的黄酮类成分对白色念珠菌的抑制作用很强。综上所述,自然界中存在很多高活性的抗真菌成分,并且随着现代提取分离技术的迅速发展以及活性筛选技术的进步,从天然产物中寻找抗真菌活性物质,并进一步研究其作用机制，将会成为抗真菌药物研究的一个重要方向14。Bader15等从毛果一枝黄花Solidagovirgaurea L的地上部分提取到了多个三萜皂苷，经微量液基稀释法证明对念珠菌属Candida的平滑念珠菌Cglabrata、克鲁斯念珠菌Ckrusei、热带念珠菌Ctropicalis有抑制作用，而且抑菌作用与糖基的取代位置及顺序有关,有待进一步研究。Bills16等从分生孢子菌Hyalodendronsp发酵液提取到2个有抗真菌作用的三萜皂苷hyalodendrosides A 和B,它们对白色念珠菌的MIC分别为128g/mL和16g/mL，对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的MIC分别为128g/mL和32g/mL，抗菌作用较强。Oberlies17等从嘉赐木属植物野生脚骨脆(拟)CaseaHa sylvestris的叶和枝中提取分离了3个二萜类化合物casearvestrinsAC。还通过琼脂扩散法研究了它们的抗真菌的活性，结果3种成分都能抑制黑曲霉菌的菌落生长。徐立春18等从银杏中分离出银杏甲素和银杏乙素，银杏乙素为黄酮类化合物，抑菌率为53。银杏甲素为银杏酸类化合物，抑菌率为92 ，除了对浅部真菌有抑制生长的作用外，对新型隐球菌、白色念珠菌等深部真菌也有明显的抑制作用。徐立春n 等从银杏中分离出银杏甲素和银杏乙素，银杏乙素为黄酮类化合物，抑菌率为53 。银杏甲素为银杏酸类化合物，抑菌率为92 ，除了对浅部真菌有抑制生长的作用外，对新型隐球菌、白色念珠菌等深部真菌也有明显的抑制作用。苦参19:成分多种生物碱，黄酮类化合物，三萜皂甙课题的研究内容、思路、方法及手段：一、研究内容:本课题的实验通过索氏提取器提取五味子花粉粗多糖，用紫外分光光度法对多糖含量进行定量测定，通过改变工艺条件，研究五味子花粉多糖的最佳提取工艺。二、拟采取的实验方案和已具备的实验条件1 材料1.1 供试材料:五倍子花粉购于 XX 药店,并由广州中医药大学中药学院药用植物学教研室王利国老师鉴定确认。1.2 试剂:95乙醇;蒸馏水;浓硫酸（比重 1.84）；蒽酮试剂、葡萄糖标准品1.3 主要仪器:索氏提取器；离心器；电子天秤;电磁炉;三角烧瓶；试管;移液管；滴管;烧杯；漏斗；纱布;蒸馏瓶(250m1);直形回流冷凝管.2 试验方法2.1 标准曲线绘制：精密称取在105摄氏度干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1000g，置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，配成浓度为1.0000mg/ml的标准溶液蒽酮试剂的配置：精确称取0.2000g，加100ml浓硫酸溶解即得，当日配置使用，将蒽酮试剂放置于棕色瓶中。精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于10ml具塞试管中，各用蒸馏水补至1.0ml，空白吸取蒸馏水1.0ml，与供试品管做以下处理:各管分别精密加入蒽酮试液5ml，摇匀，冷却至室温，以1ml蒸馏水作为空白。加热10分钟后，冷却至室温，在620nm处观察吸光度，x为葡萄糖浓度，y为吸光度，作回归处理，得到回归方程。2.2五味子花粉多糖提取工艺材料准备前处理（水浸泡）按正交试验表下各试验条件进行加热至微沸冷却离心20min减压浓缩搅拌并加入4倍量无水乙醇沉淀五味子花粉多糖静置24h离心弃去上清液蒸馏水溶解沉淀物定容作为供试品溶液。2.3 五味子花粉多糖提取条件的选择在其他条件相同的情况下，分别研究不同浸提温度（60、70、80、90、100摄氏度） 、浸提时间（1、2、3、4、5h） 、提取次数(（1、2、3、4、5次）和料液比(1：2、1：4、1：6、1：8、1：10)等单因素对五味子花粉多糖得率的影响。2.4 五味子多糖提取的正交试验在单因素试验的基础上，选择浸提温度、浸提时间、提取次数、料液比为考察因素，采用正交表 L9(3,4)进行正交试验，以粗多糖得率为考察指标，筛选最佳提取条件2.5 蒽酮硫酸法测定吸光度:提取得的五味子多糖溶液 1.00ml 于干燥容量瓶(10ml)中，蒸馏水定容至容量瓶刻度线，混匀后取 1.00ml 该溶液置于试管中，浸于冰水浴中冷却，然后一直沸水浴中加热十分钟用水冷却，室温放置 10 分钟，取出，用紫外分光光度法，在 620nm的波长处测定分光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.6测定换算因子：准确称取干燥的自制五味子花粉多糖，0.0300g，置于50ml干净烧杯中，用少量蒸馏水溶解，转入100ml容量瓶中备用，重复实验三次，计算出五味子花粉多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子：F=A/B,其中A=所配液体中多糖浓度；B=标准曲线计算所得葡萄糖浓度。五味子花粉多糖含量（%）=C*D*F*V/W其中，C为供试液中葡萄糖的浓度（mg/ml），D为供试液稀释倍数，F为换算因子，V为溶液体积（ml），W为公式花粉质量（mg）研究方案的可行性分析和已具备的实验条件：1、花粉中营养物质含量极高，其中主要成分之一就是花粉多糖。据资料，花粉起保健作用的营养成分主要是花粉多糖，故进行茶花花粉多糖的提取研究有可行性。2、五味子花粉来源广且廉价。3、实验方法及条件已具备；研究目标、主要特色及工作进度：研究目标：通过中药化学、药用植物学基础,选择五味子花粉进行条件优选研究,致力于找出五味子花粉最优提取条件。主要特色：以中医药理论为基础,结合社会需求和实际可行性进行选题;通过中药化学和中药学的知识进行中药材的选择;最后通过药用植物相关知识进行实验方案。工作进度：研究阶段 阶段成果 成果形式2010 年 10-11 月 查阅相关文献,确立研究目标并制定实验方案 申请书2011 年 11-12 月 准备课题所需物品 材料齐全 2011 年 1-2 月 进行初步实验 初步数据2011 年 3-5 月 进行系统实验并撰写论文 完整数据2011 年 6 月 答辩 毕业论文主要参考文献（注明作者、文章题目、杂志、年、卷、期、页，不少于 15 篇）：三、主要参考文献1 李道荣，李魁，段雪梅.蒲黄花粉多糖提取工艺研究.郑州工程学院学报. 2002, 23(4):55572 南京药学院 .中草药学(中册).1980,3423张国锋，刁其玉，屠焰.蜂花粉多糖的提取及其应用.饲料工业.2008，29:2 44杜晓平，郑明珠，刘景胜超声波破壁提取松花粉多糖的工艺研究J食品科学，2007，28（9）：308-311. 5肖素荣，李京东.天然食品防腐剂及其发展前景.中国食物与营养.2007,(6):306熊丽,陆琳,罗超,程天印.黄曲霉毒素的危害及检测方法的研究进展.畜牧兽医杂志.2008,27(3):39427熊丽,罗超,程天印,陆琳.黄曲霉毒素的危害及检测方法的研究进展.饲草饲料奶牛杂志.2008.(7)8 谢小梅，许杨，方建茹肉桂醛、柠檬醛对烟曲霉、黄曲霉细胞DNA、RNA的影响J中草药，2005，36(4)：5585609 罗仁夏,林如涛, 陆元斌,蔡琳.茵陈蒿对黄曲霉毒素B 1诱变效应的抑制.福建医学院学报.1990.24(4):35210刘世会,赵德刚.杜仲抗真菌肽对黄曲霉的抑制作用.天然产物研究与开发Nat Prod ResDev 2008, 20: 33233411余伯良.山苍子油对霉菌抗菌性及其与黄曲霉产毒关系的研究.微生物学通报.1998