透明质酸的提取工艺研究3稿

透明质酸的提取工艺研究摘要：论述了透明质酸的结构和理化性质，各种提取方法以及各方面的应用和发展前景。关键词：生化药物，透明质酸 (HA),提取工艺生物技术是 21 世纪技术的核心，它是利用生物体或其组织部分发展产品的技术体系，利用生物技术研究和开发的。生物技术药物与生化药物没有严格的界限，可以利用现代生化技术生产，还可以用化学方法合成或修饰，这些药物均具有疗效高、安全性强、生产污染小、原料取自天然、可生物利用等优点。在人类面临健康资源、环境、人口危机的今日，更显出其独有的魅力，在制药业已异军突起，而且生物技术制药市场方兴未艾。透明质酸是一种性能优良的生化物质，应用极其广泛，它的应用开发和生产是目前生化药界比较热门的课题。引言透明质酸（Hyaluronicacid 简称 HA）又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖类高分子化合物，基本结构由两个双糖单位 D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。分子式：（C14H20NNaO11）n ，其结构式如下如所示：与其它粘多糖不同，它不含硫。广泛存在于人和动物的结缔组织、眼球玻璃体、细胞间质、关节滑膜液、脐带、角膜、鸡冠、鸡胚及细菌壁中。由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用。它的透明质分子能携带 500 倍以上的水分，为目前所公认的最佳保湿成分，目前广泛的应用在保养品和化妆品中。1 结构及理化性质 HA 高聚物的结构单元由一分子 D-一葡萄糖醛酸与一分子 N-乙酸氨基葡萄糖以 -1，3 糖苷键连接而成，此单元的N-乙酸胺基葡萄糖又以 -1，4 糖苷键与另一单元的 D- 葡萄糖醛酸相连分子量通常为数十万。HA 具有以下理化特征：1）无定形物质；2）水溶液带负电；3）分子链间成紊乱的网状结构；4）水溶液有较好的粘弹性和渗透压； 5）分子存在大量的羟基2 透明质酸的提取方法、的生产工艺主要分为两大类：以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。本工艺中，组织提取法选取鸡冠为原料；细菌发酵法选取牛鼻粘膜，其含有能产生 HA 的链球菌。2.1 以鸡冠为原料的工艺流程鸡冠（丙酮、脱水）脱水鸡冠（蒸馏水）滤液 NaCl（氯仿提取）水相（乙醇、沉淀）透明质酸（脱水：干燥）粗品（0.1mol/LaCl 溶液）溶解液（稀 HCl，、氯仿）水相（ NaOH pH7.7 链酶蛋白酶）酶解液（氯仿）水相（氯化十六烷吡啶）沉淀（CaCl 离心）上清液（95%乙醇：沉淀）沉淀（脱水）HA 产品。2.2 发酵法生产微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以 HA 为主要成分的荚膜来生产 HA。与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液 HA 以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。2.2.1 实验材料：牛鼻黏膜 140 份。培养基。目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。其中酵母浸膏最常用。在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸, 可以提高 HA 的产率。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物, 最常用的是葡萄糖。其他还有磷酸盐、硫酸盐、钾、钠、钙、镁等无机盐。此外, 为了获得高分子量的 HA, 培养基中不能含有促使 HA 降解的金属离子, 如铁离子、铜离子; 也不能加入自由基清除剂, 以防止 HA 降解。主要有以下几种: 斜面培养基。牛脑沁液 800 mL ,牛心沁液 200 mL ,牛肉膏的质量分数为 0. 3 % ,蛋白胨为 1 % ,NaCl 为0. 5 % ,琼脂为 1. 8 % ,灭菌前 p H = 7.0 ,121 灭菌 20 min 。血琼脂平板培养基。葡萄糖的质量分数为 2 %,蛋白胨为 1 %,牛肉膏为 1 % ,MgSO4 7H2O 为 0. 1 % , KH2 PO4 为 0. 2 % ,琼脂为 1. 6 %,灭菌前 p H = 7. 0 ,121 灭菌 20 min. ,冷却至 50 以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。 摇瓶培养基。葡萄糖的质量分数为 4 % ,蛋白胨为 1 % ,牛肉膏为 1 %,MgSO4 7H2O 为 0. 1 % , KH2 PO4 为 0. 2 % ,灭菌前 p H = 7. 0 ,121 灭菌 20 min ,冷却至 50 以下,无菌条件下加入体积分数为10 %的小牛血清。2.2.2 试验方法菌种分离筛选操作方法(1) 初筛。将牛鼻黏膜用 0. 1 %蛋白胨溶液稀释成不同梯度涂于血琼脂平板,在 37 下培养 24 h 。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态,用接种针挑起看其黏度、荚膜染色和革兰氏染色 并镜检。(2) 复筛。在发酵摇瓶中接入初筛疑似菌株, 每株 3 瓶, 在 200 r/ min , 37 下培养 24 h 。用红外吸收光谱对经复筛发酵液提纯得到的多糖精品作定性分析。(3) 红外吸收光谱法。取 HA 2 mg , KBr 压片, 用 IR2400 红外分光光度计在 4000 500cm- 1 范围内扫描。2. 2.3 诱变方法人们研究发现， 链球菌属和多种细菌都有荚膜， 这种荚膜的主要成分是 HA， 同时， 在这些细菌中也含有透明质酸酶，它使 HA 降解， 所以，发酵法生产 HA 的基础是找到高产 HA， 又不产生透明质酸酶的菌种。(1) 制备菌液。菌液经 3500 r/ min 离心 10min 后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤 2 次,重新悬浮于 5 mL 生理盐水中, 摇匀后倒入盛有 45 mL 灭菌生理盐水并带玻璃珠的 100 mL 锥形瓶中,振荡 10 min , 调整细胞浓度至 108 / mL 。在进行诱变处理菌体时, 用 0. 1mol/ L 、 p H = 6. 0 的磷酸盐缓冲液代替生理盐水, 其他与供紫外线诱变处理菌体的菌液制备相同。(2) 紫外线诱变处理。紫外灯的功率为 15W ,照射距离为 30 cm。将 3 mL 菌液和磁力搅拌棒放入直径为 9 cm 的无菌培养皿中,搅拌照射时间为 2 min 。(3) N TG 诱变处理。称取 1 mg N TG 倒入无菌离心管中, 加入 0. 1 mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸缓冲液 1 mL ,暗处振荡溶解。取4 mL 菌液加入上述离心管中, 充分摇匀,立即置于 37 水浴振荡处理 30 min (N TG 处理终浓度为 100 g/mL) 后,离心收集菌体,将含 N TG 的上清液倒入浓 NaO H 溶液弃去 ,用无菌水洗涤菌体 3 次, 用大量稀释法终止 N TG 的诱变,最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水。(4) 突变株筛选。诱变处理的菌液经过中间培养稀释涂于平板上, 从血琼脂平板上挑取溶血性较弱或不具溶血性的菌株。再将其置于斜面培养基,在 37 下培养 14 16 h ,选取 23 环接入装有 50 mL 摇瓶培养基的 250 mL 三角瓶中,在 200 r/ min 的旋转摇床上培养 24 h 后测定发酵液中透明质酸的含量,选取产量提高的菌种。(5)HA 菌的提纯。目前, HA 产生菌的诱变方法多为紫外线照射和化学诱变剂等常规方法, 本实验室使用微波诱变、超声波诱变及微波- 超声波复合诱变的方法选育出高产菌株, 其诱变菌株比原始菌株透明质酸产量高出 61%, 且该菌种经 5 次传代后透明质酸产量稳定, 实验证明该诱变选育方法具有一定的研究价值。 透明质酸生产菌株的选育野生型的链球菌作为HA 产生菌, 首先要经过诱变使其成为溶血素和透明质酸酶缺陷型菌株。链球菌多会产生溶血素( Streptolysin) , 溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞和毒害心脏的作用。溶血素混入成品 HA, 还会使 HA 的品质降低, 不能用于医药品和化妆品, 所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。邓开野从血琼脂平板上筛选出一株不具有溶血性的突变菌株, 其性能比原始菌株有很大提高。2.2.4 发酵条件。 HA 发酵有需氧发酵也有厌氧发酵。有氧发酵一般产率较高且分子量高。在发酵过程中保持适当的溶氧量, 而在不同的阶段采用不同的溶氧量, 也是提高 HA 产率的手段之一。根据 HA 生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的 ATP，有利于 UTP 生成，而 UTP 是合成 HA 的两个活化前提物，即 UDP-葡糖醛酸和 UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于 HA 的合成。Nimrod 等用兽疫链球菌的一个变异菌株进行发酵，在厌氧条件下，HA 的产率为 2g/L；在通气条件下，为 4g/L6g/L。在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，也可在不同阶段采用不同的溶氧量。通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致 HA 的机械降解。在 HA 发酵过程中, pH 值一般控制在 6.08.5 范围内, 低于 6.0 或高于 8.5 会影响菌体的生长 , 降低 HA 的产率和分子量。链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸，需用碱液进行中和，以维持适当的 pH 值。发酵温度通常为37 。发酵过程中需要检测的主要参数有 pH 值、溶氧量、葡萄糖含量、发酵液粘度、HA 含量和菌体密度等。测定发酵液粘度可直观反映出 HA 产率的高低。在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在 37。发酵温度一般为 37，也有的采用 35或 33等较低的温度，或在不同的阶段采用不同的温度。在种子培养阶段和发酵的初期，37培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成 HA，提高 HA 的产率。2.2.5 工艺过程取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，37培养 12h16h，接种于种子罐中。培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖。37搅拌培养 12h16h，接种于发酵罐中。接种比例 1：10。发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为 3%6%。维持通气量 0.3vvm1.0vvm，搅拌转速 120r/min，37发酵 40h46h。在发酵过程中，发酵液的 pH 值不断下降，需调 pH6.57.0。发酵后期，葡萄糖浓度下降至 0.5%以下，pH 值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。发酵结束，用三氯乙酸调 pH4.04.5，板框过滤除菌体，滤液调 pH6.06.5，加 3 倍体积 95%乙醇，沉淀出 HA。沉淀用发酵体积的 0.1mol/L 氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的 1%CPC 与滤液中的 HA 发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。虹吸出母液，加入 0.1mol/L 氯化钠液洗涤沉淀两次。沉淀在发酵体积的 0.4mol/L 氯化钠液中搅拌解离过夜。过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得 HA如果直接用野生菌发酵, 发酵液中会有一定量 HA, 但含量极低, 一般情况下不会超过 2g/L, 得到的 HA 分子量也很低, 因此必须经过诱变、筛选等手段选育出高产菌株。而现阶段报道多以紫外诱变和化学诱变为主, 应从其它多种育种方法着手, 以期得到稳定的高产菌株。2.2.6 从发酵液中提取 HA。在后处理前, 首先要杀灭和除去发酵液中的菌体。通常加入杀菌剂或加热灭活菌体后离或过滤除菌。也有文献报道将壳聚糖或氯代十六烷基吡啶直接加入发酵液中以沉淀 HA。HA 含量较高时, 发酵液粘度很高, 需要用水稀释后再离心或过滤除菌, 滤液再经乙醇沉淀、 CPC 沉淀、超滤等方法进行分离纯化, 最后用有机溶剂沉淀、真空干燥制得最终产品。乙醇沉淀时, HA 溶液中一定要有盐的存在, 否则不会产生沉淀。常用的盐为 NaCl 和 NaAc, 浓度在 1 %左右。乙醇沉淀 HA 不仅可除去杂质,而且可以脱色。粗品制备量取一定体积发酵液,缓慢加入 2 倍体积的乙醇,边加边搅拌, 静置 2 h, 4000 rmin- 1 离心 5 min,倾去上清液,沉淀用工业乙醇脱水 3 次, 真空干燥即得 HA 粗品。6 种除蛋白方法加热法 ： 取适量 HA 粗品溶于蒸馏水中, 于 90水浴中边加热边搅拌 10 min,冷却至室温, 4000 rmin- 1 离心 5 min,弃去沉淀,上清液醇沉干燥即得 HA 精品。盐酸法提取适量 HA 粗品溶于蒸馏水中,用 10% HCl 溶液调节 pH 至 410415, 4000 rmin- 1 离心 5 min,弃去沉淀,上清液用稀 NaOH 溶液调 pH 至 610615,醇沉干燥即得 HA 精品。三氯乙酸法： 取适量 HA 粗品溶于蒸馏水中,用 10%三氯乙酸溶液调 pH 值至 410415,4000 rmin- 1 离心 5 min, 弃去沉淀, 上清液用稀 NaOH 溶液调 pH 至 610615,醇沉干燥即得 HA 精品。Sevage 法： 取适量 HA 粗品溶于蒸馏水中,加入总体积 1 /5 的氯仿和氯仿体积 1 /5 的正丁醇,剧烈振摇 20 min,静置分层,弃去蛋白乳化层。按上述方法重复 4 次后,上清液醇沉干燥即得 HA 精品。氯仿法： 取适量 HA 粗品溶于蒸馏水中,用 10% HCl 溶液调 pH 至 510,加入等体积的氯仿,振摇 20 min,静置分层,弃去下层氯仿及中间的蛋白乳化层,再向上清液中加入等体积的氯仿 ,重复上述操作 2 次后,弃去乳化层及氯仿,上清液醇沉干燥即得 HA 精品。等电点沉淀法： 取适量 HA 粗品溶于蒸馏水中,加热至 55 60, 过滤,滤液用 5 molL - 1NaOH 溶液调 pH 至10101015,过滤,再用 10%HCl 溶液调 pH 至 610615,过滤, 滤液加入约 23 倍体积工业乙醇沉淀,沉淀用蒸馏水溶解, 再用 5 molL - 1 NaOH 溶液调 pH 至 10101015,过滤,然后用 10% HCl 溶液调 pH 至 610615, 过滤, 滤液醇沉干燥即得 HA精品。3 透明质酸的特性及用途HA 具有许多天然粘多糖共有的性质：呈白 色、为无定形固体、无臭无味、具有强烈的吸湿 性、溶于水、不溶于有机溶剂。由于直链轴上单糖 之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的 螺旋柱型 ，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生 强烈的亲水性；同时羟基的连续定向排列，又在分 子链上形成高度的憎水区， HA 分子的亲水和憎水 特性，使得浓度低于 1的 HA 也能形成连续的三 维蜂窝状网络结构_2j，水分子则在网络内通过极性 键和氢键与 HA 分子相结合，使得这些水在柱内固 定不动，不易流失， HA 亲和吸附的水分约为其本身重量的 1000 倍，这是其它粘多糖无法比拟的所以 HA 是理想的保水剂，是目前自然界中发现的 保水性最好的天然物质。透明质酸可分为:1)化妆品级透明质酸。透明质酸是皮肤和其它组织中广泛存在的天然生物分子，具有极好的保湿作用，被国际上称为理想的天然保湿因子。大分子透明质酸（分子量范围 1 800 0002200 000）可在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害； 中分子透明质酸（分子量范围 1 000 0001 800 000）可以紧致肌肤，长久保湿； 小分子透明质酸（分子量范围 400 0001 000 000）能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。衡量一个好的护肤品是以含有三种不同分子量的透明质酸成分为衡量标准的，只含有单一分子量透明质酸成分的护肤品作用有限，并不能发挥透明质酸的最佳护肤功效。2）医药级透明质酸 透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。3和食品级透明质酸。人体中的透明质酸含量约为 15g，在人体的生理活动中发挥着重要作用。皮肤中的透明质酸含量减少，皮肤的保水功能减弱，显得粗糙并产生皱纹；其它组织和器官中的透明质酸减少，可导致关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等。人体中透明质酸的减少会产生早老症。美容行业透明质酸类可做填充剂注射。有去皱、丰唇、填充脸部、隆鼻和填充凹痕等美容手术应用透明质酸副作用偶尔出现荨麻疹、皮症瘙痒感，应停药，适当处理。有时出现疼痛、肿胀，偶尔出现水肿、发红、热感、局部重压感。参考文献:【1 】朱广华, 喻红, 等 实验室阶段细菌发酵合成透明质酸 J 1 南 京铁道医学院学报, 1998, 17 ( 1) : 92111【2】 李 宝 璋 ，杨 斌 ，赵 峰 ，等 .透明质酸提取方法进展 J.西 北大学 学 报. 1993,(8):392-396.【3】郭学平, 王春喜, 等 透明质