生物化学与分子生物学学习指导与习题集

简明生物化学与分子生物学学习指导与习题集陈晓光简明生物化学与分子生物学 （周慧主编）是教育部制药工程专业教学指导分委员会组织编写的高等学校制药工程专业系列教材之一，全书由 20 章组成，分为四个部分：第一部分从第一章至第五章，主要为生物大分子的结构与性质，包括蛋白质、酶、核酸、糖类和脂质的结构与性质；第二部分从第六章至第九章，主要为物质代谢，介绍了蛋白质、核酸、糖类和脂质的分解与合成代谢；第三部分从第十章至第十五章，主要内容是分子生物学，包括原核生物和真核生物染色体结构与 DNA 复制、基因的转录与转录活性的调节、蛋白质生物合成机制与调节；第四部分从第十六章至第二十章，为分子生物学实验方法，包括核酸的分离纯化、基因重组技术、聚合酶链反应、核酸测序和核酸的分子杂交。为了帮助学生更好地理解和掌握教材，我们编写了配套的学习指导用书。本学习指导与习题集在内容上按教材编排章节顺序编写，每章内容包括五个部分：学习目标、学习内容纲要、学习要点、 “习题练习” 、 “参考答案”组成。“学习目标”以“掌握” 、 “熟悉” 、 “了解”三个不同层次要求学习每章内容，加强理解，可作为教学大纲要求。“学习内容纲要” 简要介绍每章学习内容概要。“学习要点”概括介绍每章需要重点学习掌握的基本概念、主要内容、相互联系。包括一些生物大分子的分类，结构特点，重要的理化性质，酶学研究的动力学特征；重要的物质代谢途径，关键酶，代谢通路的生理意义；遗传分子生物学中心法则，DNA、RNA、蛋白质生物合成的各自体系组成及其功能，主要的合成过程及特点，基因重组操作的基本原理及过程等。“习题练习”分为“选择题” 、 “填空题” 、 “判断题” 、 “名词解释”及“问答题”等多种形式，主要根据教材内容、大纲要求进行设计，以帮助学生学习理解教材内容，并有助于记忆。全部习题均有相应“参考答案” ，便于学习者复习或自学。本书适用于制药工程专业本科生学习巩固所学知识和考研复习，也可作为相关学科学生、教师的教学参考用书。绪论 一、生物化学的的概念： 生物化学（biochemistry)是运用化学的理论和技术，研究生物体的物质组成与结构、物质代谢与能量转变，以及与生理功能之间关系的一门科学。生物化学（biochemistry)， 即生命的化学，是利用化学的原理与方法去探讨生命的一门科学，是一门研究生物体的化学组成、体内发生的反应和过程的学科。当代生物化学的研究揭示组成生物体的物质，特别是生物大分子(biomacromolecules)的结构规律，并且与细胞生物学、分子遗传学等密切联系，研究和阐明生长、分化、遗传、变异、衰老和死亡等基本生命活动的规律。二、分子生物学的概念：Watson 和 Crick 于 1953 提出了 DNA 分子的双螺旋结构模型，在此基础上形成了遗传信息传递的“中心法则”，由此奠定了现代分子生物学(molecular biology)的基础。分子生物学主要研究生物体所含基因的结构、复制和表达，以及基因产物蛋白质或RNA 的结构，互相作用以及生理功能。总之，生物化学与分子生物学是在分子水平上研究生命奥秘的学科，代表当前生命科学的主流和发展的趋势。三、生物化学的发展： 1叙述生物化学阶段：是生物化学发展的萌芽阶段，其主要的工作是分析和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物。 2动态生物化学阶段：是生物化学蓬勃发展的时期。就在这一时期，人们基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。 3分子生物学阶段：这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。 四、生物化学研究的主要内容： 1.生物大分子的结构与功能 2.物质代谢及其调节3.基因信息的传递1生物体的物质组成：高等生物体主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类以及水、无机盐等组成，此外还含有一些低分子物质。 2物质代谢：物质代谢的基本过程主要包括三大步骤：消化、吸收中间代谢排泄。其中，中间代谢过程是在细胞内进行的，最为复杂的化学变化过程，它包括合成代谢，分解代谢，物质互变，代谢调控，能量代谢几方面的内容。 3细胞信号转导：细胞内存在多条信号转导途径，而这些途径之间通过一定的方式相互交织在一起，从而构成了非常复杂的信号转导网络，调控细胞的代谢、生理活动及生长分化。4生物分子的结构与功能：通过对生物大分子结构的理解，揭示结构与功能之间的关系。 5基因信息的传递遗传与繁殖：对生物体遗传与繁殖的分子机制的研究，也是现代生物化学与分子生物学研究的一个重要内容。 五、生物化学与分子生物学与药学学科的关系及其在制药工业中的重要性生物化学与分子生物学是药学学科重要的理论基础, 药学生物化学与分子生物学是研究与药学科学相关的生物化学与分子生物学理论、原理与技术及其在药物研究、药品生产、药物质量控制与临床应用的基础学科。它从分子水平研究生命现象本质,是研究疾病, 研究药物治病原理不可缺少的基础。 生物化学与分子生物学理论及其技术的发展与现代药学科学的发展具有越来越来密切的联系，是中药学的有效成分分离纯化研究、药物化学的新药设计研究、药理学的生化机理研究、生物药剂学的代谢研究的重要理论基础。 生物化学与分子生物学的进展，为新药的发现提供了理论、概念、技术和方法，使药学科学步入一个新的发展阶段，其特点是以化学模式为主体的药学科学迅速转向以生物学和化学相结合的新模式。因此生物化学与分子生物学在当代药学科学发展中起到了先导作用。生物化学与分子生物学在当代制药工业发展中起到了重要作用，以分子生物学 DNA 重组技术为基础发展起来的生物制药工业开创了制药工业一个新门类。作为制药工程专业学生,学习生物化学与分子生物学主要是学习与药学相关较紧密领域的知识,包括生物化学与分子生物学的基础理论及技术,为今后学习其它各有关药学专业的课程奠定基础。第一部分 生物大分子第一章 蛋白质学习目标1、掌握：氨基酸和肽的基本结构、蛋白质的结构与功能。2、熟悉：蛋白质分离纯化的方法及原理。3、 了解：蛋白质一级结构的测定方法，蛋白质的结构与功能的关系；生理活性肽。学习内容纲要1、氨基酸的结构与性质2、肽键3、生理活性肽4、蛋白质分离和纯化的方法及原理5、蛋白质的结构与功能学习要点第一节、 氨基酸的结构与性质 1氨基酸的概念：氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本结构单位。构成蛋白质分子的氨基酸共有 20 种，这些氨基酸都是 L-构型的 -氨基酸。2氨基酸分子的结构通式： 3、氨基酸分类：按带电荷情况可分为三类：侧链不带电荷氨基酸：非极性中性氨基酸(8 种) （Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp） ；极性中性氨基酸(7 种)（Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln） ；带负电荷氨基酸 2 种（酸性氨基酸 Asp、Glu） ；带正电荷氨基酸 3 种（碱性氨基酸 His、Arg、Lys） 。4、氨基酸构型（结构特点）：构成蛋白质分子的 20 种氨基酸，除脯氨酸为 -亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为 L-氨基酸。 5、氨基酸的等电点氨基酸不带电荷时，溶液的 pH 值称为该氨基酸的等电点，以 pI 表示。氨基酸不同，其等电点也不同。也就是说，等电点是氨基酸的一个特征值。6、 氨基酸的茚三酮反应如果把氨基酸和茚三酮一起煮沸，除脯氨酸和羟脯氨酸显黄色外，其它氨基酸都显深浅不同的紫色。氨基酸与茚三酮的反应，在生化中是特别重要的，因为它能用来定量测定氨基酸。7、非蛋白质氨基酸除了蛋白质中常见的 20 种氨基酸及相应的衍生氨基酸外，还有 200 多种氨基酸以游离或结合的形式存在于生物界，但并不是蛋白质的组成成分，这些氨基酸统称为非蛋白质氨基酸，如 -丙氨酸，鸟氨酸等。第二节、 肽键： 1、肽键: 一个氨基酸的 -羧基与另一个氨基酸的 -氨基以共价键偶联形成肽，其间的化学键称为肽键(peptide bond)，也叫酰胺键(-CO-NH-)。2、氨基酸残基：氨基酸分子在参与形成肽键之后，由于脱水而结构不完整，称为氨基酸残基。每条多肽链都有两端：即自由氨基端(N 端)与自由羧基端(C 端)，肽链的方向是 N 端C 端。 3、肽键平面(肽单位)： 肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转；组成肽键的四个原子及其相邻的两个 碳原子处在同一个平面上，为刚性平面结构，称为肽键平面。4、肽（peptide）是氨基酸通过肽键相连的化合物。肽按其组成的氨基酸数目为 2 个、3个和 4 个等不同而分别称为二肽、三肽和四肽等，多肽和蛋白质的区别是多肽中氨基酸残基数较蛋白质少，一般少于 50 个，而蛋白质大多由 100 个以上氨基酸残基组成，但它们之间在数量上也没有严格的分界线。第四节、蛋白质的分离和纯化1、蛋白质的分离、提纯一般程序：一般的蛋白质需要在细胞破碎后用适当溶剂（如水、稀盐溶液、缓冲液等）将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。从总体上来讲，分离纯化蛋白质在对材料进行前处理后需要用沉淀法进行初步分离，之后再以层析或电泳法得到所需的蛋白质产物。 （图 1-6）（1）前处理：细胞破碎、离心；（2）初分离：沉淀法；（3）精制：层析、电泳。图 1-6 分离纯化蛋白质程序示意图在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。2、盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。蛋白质的等电点概念：蛋白质分子所带正、负电荷相等时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。 pH 值在等电点以上，蛋白质带负电，在等电点以下，则带正电。溶液的 pH 在蛋白质的等电点处蛋白质的溶解度最小。蛋白质的有机溶剂沉淀：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白质沉淀。 3、层析：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离。主要有：（1）离子交换层析原理：根据被分离物蛋白质分子所带电荷不同，使用不同离子交换剂，将蛋白质分子分离开；（2） 凝胶过滤层析原理：凝胶过滤也叫分子筛层析。它主要是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物蛋白质分子的大小不同来进行分离的。其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。（3） 亲和层析原理：利用蛋白质分子与其它生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。4、电泳原理：蛋白质分子在高于或低于其 pI 的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。 SDS-PAGE 电泳原理：SDS-PAGE 是一种电泳方式，该法是采用去污剂即十二烷基磺酸钠使蛋白质变性后进行的一种电泳（SDS: 十二烷基磺酸钠 Sodium dodecyl Sulfate;PAGE:聚丙烯酰铵凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis） 。 （1）绝大多数蛋白质都能与 SDS 分子结合，由于SDS 带有负电荷，大量的 SDS 负电荷屏蔽了蛋白质本身所具有的电荷，因此经 SDS 处理后的蛋白质都具有负电荷，向正极移动。 （2）SDS-PAGE 完全是基于凝胶过滤效应分离蛋白质，不同分子量的蛋白质形成不同的区带。 （3）此外，由于 SDS 干扰了蛋白质亚基间疏水相互作用，所以在 SDS-PAGE 中多亚基蛋白质分离成单亚基形式存在。在凝胶上蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，因此，可用该法测定蛋白质的分子量，其准确率为 510%。5超速离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数 S 成正比。 6透析：利用透析袋膜的超滤性质，可将大分子物质与小分子物质分离开。 第五节、蛋白质的结构与功能： 一、蛋白质的生物功能：生物催化、机械支撑作用、运输与贮存、协调、免疫保护、生长与分化调控、细胞信号转导、物质跨膜运输、电子传递等。二、蛋白质的分子结构：可为分为一级、二级、三级和四级结构等层次。一级结构为线状结构，二、三、四级结构为空间结构。蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的物质基础.1一级结构：指多肽链中氨基酸的排列顺序，其维系键是肽键。蛋白质的一级结构决定其空间结构。 2二级结构：指多肽链主链骨架盘绕折叠而形成的构象，借氢键维系。二级结构是肽链的局部空间结构，它是蛋白质复杂空间结构形成的基础，因此也称为构象单元。主要有以下几种类型： -螺旋：其结构特征为：主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；螺旋每上升一圈是 3.6 个氨基酸残基，螺距为 0.54nm； 相邻螺旋圈之间形成许多氢键； 侧链基团位于螺旋的外侧。 -折叠：其结构特征为： 若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片； 所有肽键的C=O 和 NH 形成链间氢键。无规卷曲：主链骨架无规律盘绕的部分。 蛋白质的超二级结构和结构域在蛋白质（特别是球状蛋白）的结构中，经常会出现两个或几个二级结构单元被连接起来，进一步组合成有特殊的几何排列的局域空间结构，这些局域空间结构称为超二级结构（Supersecondary structure） ，或简称模体（Motif） 。超二级结构可以视为是处于二级结构与三级结构之间的一个结构层次。现在已知的超二级结构有 3 种基本的组合形式：，。多肽链还会在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，称为结构域（Structural domain） 。对于一些简单的球状蛋白分子来说，它还可能是一个独立的功能单位或功能域（functional domain） 。3三级结构：结构域、二级结构、超二级结构的多肽链在空间进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布，这就是蛋白质的三级结构（Tertiary structure） 。对于一些较小的蛋白质分子，三级结构就是它的完整三维立体结构；而对于大的蛋白质分子，则需要通过三级结构单位的进一步组织才能形成完整分子。其维系键主要是非共价键（次级键）：氢键、疏水键、范德华力、离子键等，也可涉及二硫键。 4四级结构：亚基的概念：亚基是指参与构成蛋白质四级结构的而又具有独立三级结构的多肽链。四级结构的概念：含两条以上肽链的蛋白质分子，每条肽链彼此以非共价键相结合，这些肽链称为亚基（Subunit） 。通过非共价键形成大分子体系时，亚基间的组合方式称为蛋白质分子的四级结构（Quaternary structury） 。其维系键为非共价键。一般来说，单独存在的亚基并没有完整的生物活性，只有具有完整的四级结构的寡聚体才具有生物活性。 维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力主要是弱的相互作用称非共价键或次级键，包括氢键、范德华力、静电作用、疏水作用等。其中以氢键和疏水作用是维持蛋白质空间结构的最重要因素。三、蛋白质一级结构的测定： 蛋白质一级结构的测定1、多肽链蛋白质一级结构的测定以胰岛素为例s A 链s sB 链测定步骤：（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目（2） 多肽链的分离及降解（3） 肽段的分离和顺序分析（4） 二硫键SS定位。2、单肽链蛋白质的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要有以下几个步骤： （1）分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品； （2）完全水解，测定蛋白质的氨基酸组成； （3）分析蛋白质的 N-端和 C-端氨基酸； （4）将蛋白质处理为若干条肽段,采用特异性的酶（如胰凝乳蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰） ； (5) 分离纯化单一肽段； (6) 测定各条肽段的氨基酸顺序。一般采用 Edman 降解法，用异硫氰酸苯酯进行反应，将氨基酸降解后，逐一进行测定； (7) 至少用两种不同的方法处理蛋白质，分别得到其肽段的氨基酸顺序； (8) 将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。 四、 蛋白质的理化性质： 1蛋白质的变性：蛋白质在某些理化因素的作用下，其特定的空间结构被破坏而导致其理化性质改变及生物活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。引起蛋白质变性的因素有：高温、高压、电离辐射、超声波、紫外线及有机溶剂、重金属盐、强酸强碱等。绝大多数蛋白质分子的变性是不可逆的。复性(renaturation)：当无活性的伸展的蛋白质进入有利于折叠的最适环境里，则伸展的肽链就会自动折叠成天然的折叠肽，并恢复全部的活性，称为复性。2两性解离与等电点：蛋白质分子中仍然存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质。蛋白质分子所带正、负电荷相等时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。 3蛋白质的紫外吸收：蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为 280nm。 4蛋白质的胶体性质：蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。第一章 蛋白质习题一、名词解释1、肽键(peptide bond) 2、蛋白质的等电点(isoelectric point of protein)：3、蛋白质的变性(denaturation of protein)4、亚基(subunit)5、盐析 6、离子交换层析7、凝胶过滤层析8、亲和层析9、电泳10、氨基酸11、蛋白质的紫外吸收12、氨基酸的茚三酮反应二、填空题1、组成蛋白质的元素有_、_、_、_。含量恒定的元素是_，其平均含量为_。2、蛋白质结构的基本单位是_，结构通式为_ 。3、肽是氨基酸与氨基酸之间通过_ 相连的化合物。4、蛋白质的二级结构形式有_、_、_、_。5、维持蛋白质空间构象的非共价键有_、_、_、_。7、 氨基酸在等电点(PI)时，以_离子形式存在，在 PHPI 时以_离子存在，在PHPI 时，以_离子形式存在。8、氨基酸与茚三酮的反应，除脯氨酸和羟脯氨酸显黄色外，其它氨基酸都显_。在生化中是特别重要的，因为它能用来定量测定_。9、 酸性氨基酸基酸有_、_；碱性氨基酸有_、_、_。含巯基的氨基酸是_。三、单项选择题1有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的 pI 分别为 4.6、5.0、5.3、6.7、7.3。电泳时欲使其中 4 种泳向正极，缓冲液的 pH 应该是 ( )A5.0 B4.0 C6.0 D7.0 E8.02蛋白质分子引起 280nm 光吸收的最主要成分是 ( )A肽键B半胱氨酸的-SH 基 C苯丙氨酸的苯环D色氨酸的吲哚环E组氨酸的咪唑环3含芳香环的氨基酸是 ( )ALys BTyr CVal DIle EAsp4变性蛋白质的特点是 ( )A黏度下降 B丧失原有的生物活性 C颜色反应减弱D溶解度增加 E不易被胃蛋白酶水解5蛋白质变性是由于 ( )A蛋白质一级结构改变 B蛋白质空间构象的改变C辅基的脱落 D蛋白质水解 E以上都不是6以下哪一种氨基酸不具备不对称碳原子 ( )A甘氨酸 B丝氨酸 C半