大肠杆菌中的基因表达.ppt

1、第二章 基因工程制药,第一节 概 述第二节 目的基因的获得第三节 基因表达第四节 基因工程菌的不稳定性第五节 基因工程菌中试第六节 重组工程菌的培养第七节 基因工程药物的分离纯化第八节 变性蛋白的复性第九节 基因工程药物的质量控制,第二章 基因工程制药,一、基因工程技术生产药品的优点 二、基因工程药物生产的基本过程 三、国内外基因工程药物研究进展,基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展 基因工程： 应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物 遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品 和服 务的技术。,1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以

2、获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。 3. 开发更多的内源性生理活性物质。 4. 通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优 化天然的生理活性物质。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 6. 降低成本，提高产品质量。,1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验,目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子 表皮生长因子、凝血因子； 3

3、. 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4. 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激 活剂、超氧化物歧化酶等。,Vitamin A,一、 反转录法 二、化学合成法,1mRNA的纯化 （1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。 （2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）,2cDNA第一链的合成（RT-PCR，随机引物） 3cDNA第二链的合成 4cDNA克隆 5将重组体导入宿主细胞,6cDNA文库的鉴定,7目的cDNA克隆的分离和鉴定,优点：准确性高、人工接头、改进、利用 局限性： 1小分子量的蛋白或多肽 2已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3费用较高,Vita

4、min B2,基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。,1. 原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等） 2. 真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）,1原核细胞 （1）大肠杆菌 优点：遗传背景清晰，生长迅速。 缺点：胞内表达，提取困难。 包含体形式，需复性。 表达后不存在修饰作用，应用受限。 翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子 编码）容易引起免疫反应。 大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。 蛋白酶水解作用破

5、坏产物。,1原核细胞 （2）枯草芽孢杆菌 优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。 缺点：蛋白酶水解活性更强。 （3）链霉菌 优点：不致病 分泌能力强 具有糖基化能力 缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差,2真核细胞 （1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。 （2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。 （3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。,1载体 表达载体必须具备下列条件： 载体能独立复制 具有多克隆（MCS）位点和标记基因 具有很强的启动子 具有调节基因 具有很强的终止子 具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力,基因工程药物研究中常用的表达载体 （1）P

6、BV220系统 PL、PR串联启动子，增强启动信号。 rrnB基因的终止信号。 PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。 CITS857抑制子基因（温控诱导） 质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因,PBG-2: 由PBV220衍生,可以表达与 IgG结合的融合蛋白，并且是有蛋 白剪切位点，便于表达后纯化及 纯化后剪切。,（2）PET系统 IPTG诱导（异丙基-硫代-D-半乳糖苷） 多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点，切开后粘性末端为 ATG，便于外源基因插入表达。 在外源基因的N末端可融合6个His，便于纯化。,2影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （

7、2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响,3表达形式 （1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。,1载体 YEP类（酵母附加体质粒） 由大肠杆菌质粒，2m质粒和Trp或URA3组成， ARS来自2m质粒。 YRP（酵母复制型质粒） ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。 YCP（酵母着丝粒型质粒） 除具有YRP元件外，还具有着粒成份。,YIP（酵母整合型质粒） 含有可与染色体进行同源重组的序列 酵母表达型质粒 分泌型表达质粒 带有控制蛋白质分泌的信号序列,2影响目的

8、基因在酵母中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）TATA盒启动子成分 （3）分泌信号序列 （4）终止序列 （5）翻译后修饰 （6）对宿主影响,基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象， 质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。,1. 质粒的分裂不稳定性： 指工程菌分裂时出现一定比列不含质粒的子代菌的现象。 主要与两个因素有关： （1）含质粒菌产生不含质粒子代的频率，质粒丢失率与 宿主菌、质粒特性和培养条件有关。 （2）含质粒菌与不含质粒菌比生长速率的差异的大小。 2. 质粒的结构不稳定性： 指DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。,1. 选择合适的宿主菌 2. 选择

9、合适的载体 3. 选择压力 4. 分阶段控制培养 5. 控制培养条件 6. 固定化,一、工程菌选择 二、反应器（发酵罐）设计 三、发酵培养基组成 四、工艺最佳化与参数监测控制,一、基因工程菌的培养方式 二、基因工程菌的培养工艺 三、基因工程菌的培养设备,基因工程产品纯化前的性质： 目的产物在体系中含量较低 体系中组份复杂（细胞、代谢物、残留培养基及无机盐等） 目的产物稳定性差：对pH、温度、金属离子、有机溶剂、 剪切力、表面活性剂等十分敏感，容易失活、变性。,1. 含目的产物的初始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素 均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包

10、括： （1）菌种类型、形式，各种生物学性质，产物和副产物种类、 产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体）， 代谢物种类，产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等； （2）原材料和培养基的来源及质量是否稳定； （3）生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式(连续、批 式、半连续)，生产周期，生产能力，工艺控制条件及方式等； （4）初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质 种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性 质和热力学性质等。,2. 物料中杂质种类和性质 物料中杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、 化学性质、结构、相对分子质量、电荷性

11、质及数量、生物学特性、 稳定性(对热、pH、盐、有机溶剂等)、溶解度、分配系数、挥发性 及吸附性能等。,3. 目的产物的特性 目的产物特性主要有产物的化学、物理和生物学特性。 包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性(对热、冷冻、pH、盐、有机溶剂和金属离子等)、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物活性、亲和性、配基种类、表面活性等。,4. 产品质量要求 产品质量要求主要包括产品质量指标，产品用途，对纯度、生 物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质 的种类和最大允许量，以及对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性 等。,基因工程药物的分离纯

12、化一般包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初 步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工等步骤。,分离纯化的技术特点： 条件温和 选择性好 收率要高 纯化过程快速,1. 细胞收集 2. 细胞破碎,物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、 超声破碎法、高压挤压法,化学破碎法：渗透冲击、增溶法、 脂溶法,生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 壳多糖酶等）,超声破碎法,分离细胞碎片常用的方法有： 离心沉淀：高速离心、超速离心 膜过滤：微滤、超滤和反渗透 双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖 聚乙二醇-无机盐,分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括： 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高

13、效液相色谱等。,1. 离子交换层析： 是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。 pH、两性分子、侧链、,2. 疏水层析： 是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 疏水层析最常用填料是多聚糖（如琼脂糖）及硅胶。 利用氨基酸侧链的疏水键。,3. 亲和层析： 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。,4. 凝胶过滤层析： 又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料

14、为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。 大分子先从色谱柱中流出,1. DNA的去除 （1）DNA在pH 4. 0以上呈阴离子，可用阴离子交换剂吸附除去， 但目的蛋白质PI应在6. 0以上。 （2）如蛋白质为强酸性，则可选择条件使其吸附在阳离子交换剂 上，而不让DNA吸附上去。 （3）利用亲和层析吸附蛋白质，而DNA不被吸附，也可分离。 （4）疏水层析对分离也有效，在上柱时需要高盐浓度，使DNA-蛋 白质结合物离解，蛋白质吸附在柱上，而DNA不被吸附。,2. 热原质的去除 （1）整个生产过程在无菌条件下进行，防止产生热原质。 （2）所有层析介质在使用前先除去热原质，在28下进

15、 行操作，洗脱液需先经无菌处理，流出的蛋白质溶液 也应无菌处理，即通过0. 2m微滤膜，并在28下保存。,3. 病毒的去除 成品中必须检查是否含有病毒。病毒主要来源于宿主细胞。经过色谱分离， 一般能除去病毒，必要时可以用紫外线照射使病毒失活，或过滤将病毒除去。,根据产物表达形式来选择 根据分离单元之间的衔接选择 根据分离纯化工艺的要求来选择 （1）要具有良好的稳定性和重复性。 （2）要尽可能减少组成工艺的步骤。 （3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设 备也能相互适应。 （4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干 扰产品质量。 （5）工艺时间要尽可能短。

16、 （6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低。 （7）具有较高的安全性。,一、包含体形成的原因 二、包含体的分离和溶解 三、包含体蛋白复性方法,包含体形成的原因主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚 集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成。 重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，也导致包含体的形成。,电镜下包含体颗粒,包含体虽然由无活性的蛋白组成，但包含体形成对重组蛋白的生产提供了几个优势： 包含体具有高密度，易于分离纯化； 重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白

17、的降解； 用于生产处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白。,1.包含体的分离 （1）对培养收集的重组菌进行破碎（高压匀浆、超声波破碎等），为了提 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。 （2）离心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低浓度的变性剂（如脲和盐酸 胍）、去垢剂（如Triton X-100）、脱氧胆酸钠等化合物的缓冲液进行 洗涤，如果需要对包含体进行纯化，一般多采用蔗糖密度梯度离心法。,2.包含体的溶解 包含体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，或去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等；对于含有半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇及半胱氨酸。温度一般

18、选择在30以促进溶解。此外，由于金属离子具有氧化催化作用，还常常需要加入金属螯合剂如EDTA以除去金属离子。,有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点： 活性蛋白质的回收率高。 正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。 折叠复性方法易于放大。 复性过程耗时较少。,一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点 二、生物材料的质量控制 三、培养过程的质量控制 四、纯化过程的质量控制 五、目标产品的质量控制,产品安全性评价 根据各个具体品种的情况，提出各不相同的安全性评价要求，这类制品安全性临床试验设计方案与试验范围须根据不同情况作不同规定。,2. 产品本身的

19、结构 基因工程产品或人的多肽和蛋白质相同，或其氨基酸序列或翻 译后修饰上存在差异，或是非人源性或外源多肽和蛋白质，如病毒、 细菌抗原。对上述后两类产品，视其特点作药动学、毒理学研究。对 基因修饰产品，要作一般毒性、长期毒性以及致突变、致癌变和致畸 变等遗传毒理研究。,3. 严格控制条件 宿主细胞中表达的天然基因，转录或翻译后，或精制、工艺放大过 程中，都有可能发生变化，故从原料到制成品制备全过程的每一步都 须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效。,原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性， 重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的 安全性和一致性，所

20、以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达 载体以及宿主细胞的检查。,1.目的基因 根据指控要求，需明确目的基因的来源、克隆经过；对于改造 过的基因应说明被修改的密码子、被切除的肽段及拼接的方法； 使用PCR技术扩增得到的基因，应说明扩增的模板、引物及酶反应 条件等情况，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等分析方法 确证基因结构的正确无误。,2. 表达载体 应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分(如复制 子、启动子)的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性 标记物等。,3.宿主细胞 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其 生物学特性等；需阐明载体引入宿主细胞的

21、方法及载体在宿主 细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细 胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧 端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控 制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。,在贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过积中，要求质粒稳定，始终无突变；重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。,1.生产用细胞库 需证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污 染，由原始种子批建生产用工作细胞库。 在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种， 一个工作人员也不得同时操作两种不同的细胞或菌种。 建原始种子批须确证

22、克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、 方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并 控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞 /载体系统稳定性确定最高允许传种代数。,2.培养过程 培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞 长期培养后的基因型特征； 依宿主细胞/载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间， 并定期评价细胞系统和产品。 培养周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性。,分离纯化过程中，常用分级沉淀、超滤、电泳和色谱等技术，其质量控制要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋

23、白质、纯化过程带入的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在规定限度以下。,纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测。 要明确使用的纯化方法的原理、目的以及预期的去除杂质的效果，在不同纯化步骤中能去除不同性质的杂质，并进行相应的工艺验证。 纯化方法的设计应考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖以及纯化过程带入的其他有害物质。 纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物质。,如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上 不会掉下有害物质。 上样前应清洗除去热原质等。 若用亲和层析技术，不应含有可

24、测出的异种免疫球蛋白。 如在反相纯化步骤中用到乙腈或甲醇等有机溶剂，用Protein A亲 和层析纯化抗体，有机溶剂和Protein A等这些对人体有害的物质应加 以去除和控制。,基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求： 产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 需要综合利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学 和分子生物学等多门学科的理论与技术，保证基因工程药品的 安全有效。,1生物活性测定 多肽和蛋白质药物的生物学活性是蛋白质药物的重要质量控制指标。 效价测定必须采用国际上通用的方法，测定结果必须用国际或国家标 准品进行校正，以国际单位表示或折算成国际标准单位。 生物学效价的测

25、定往往需要进行动物体内试验或通过细胞培养进行体 外效价测定。 体内生物活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学 模型。 体外生物活性测定的方法有细胞培养计数法、3H-TdR掺入法和酶法 细胞计数等。,蛋白质的比活性是每毫克蛋白质的生物学活性。它不仅是含量指标，也是纯度指标。 由于蛋白质的空间结构不能常规测定，而蛋白质空间结构的改变，特别是二硫键的错配，可影响蛋白质的生物学活性，从而影响蛋白质药物的药效，比活性可以间接地反应这一情况。,2理化性质鉴别 （1）非特异性鉴别 根据还原型电泳的迁移率和高效液相色谱的保留时间和峰型来 进行分析。 （2）特异性鉴别 利用免疫印迹、免疫电泳、免疫

26、扩散等免疫学方法，确定蛋白 质的抗原性。,（3）相对分子质量测定 蛋白质相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和 SDS-PAGE法，凝胶过滤法测定完整的蛋白质相对分子质量， 而SDS-PAGE法测定蛋白质亚基的相对分子质量。 （4）等电点测定 样品用等点聚焦法测定等电点。在生产过程中，批与批之 间的电泳结果应该一致，以此控制生产工艺的稳定性。,（5）肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进 行分离分析。是一种检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。 肽图分析可作为制品与标准品作精密比较的手段，与氨基酸成 分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。 该技术灵敏高效

27、，是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性 进行评价和验证的首选方法。 同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳定性的验证指标。,蛋白质降解形成的肽段的鉴定可以用SDS-PAGE电泳法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）、毛细管电泳法及质谱法来测定。,（6）氨基酸组成分析 一般对含50个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析接近 理论值。 完整的氨基酸成分分析结果，应包括甲硫氨酸、胱氨酸和 色氨酸的准确值。 氨基酸成分分析结果应为三次分别水解样品测定后的平均 值。测定的重组蛋白质的氨基酸组成应与标准品一致。 氨基酸组成分析采用氨基酸

28、自动分析仪测定，包括蛋白质 水解、自动进样，氨基酸分析、定量分析报告等内容。,（7）部分氨基酸序列分析 此项是重组蛋白质的重要鉴别指标，一般要求对中试前 三 批产品至少应该测定N端15个氨基酸，C端应根据情况测定 13个氨基酸。 （8）蛋白质二硫键分析 测定巯基的方法有别PMCB法、DTNB法、NEMI法等。,3.蛋白质含量测定 主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。 蛋白质含量可根据其物化性质采用Folin-酚试剂法、染色 法（Bradford）、双缩脲法、紫外吸收法，HPLC法和凯氏定 氮法等方法，其中Folin-酚试剂法、染色法是在质量检定中常 使用的方法。,4.蛋白质纯度分析 纯度分

29、析是基因工程药物质量控制的关键项目。测定蛋白 质含量可根据其本身理化性质和生物学特性设计。通常采用的 方法有还原性及非还原性SDS-PAGE、等电点聚焦、各种 HPLC及毛细管电泳等。,5.杂质的检测 基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。,（1）蛋白类杂质 在蛋白类杂质中，最主要的是纯化过程中残余的宿主细胞蛋白。 测定采用免疫分析的方法。同时需辅以电泳等其他检测手段补充和验 证。 除宿主细胞蛋白外，目的蛋白本身也可能发生某些变化，形成在 理化性质上与原蛋白质极为相似的蛋白杂质，在体内往往会导致抗体 的产生，在质量控制中也要加以严格控制。,（2）非蛋白类杂质 具有生物学作用的非蛋白类杂质主要有病毒和细菌等微生物、热 原质、内毒素、致敏原及DNA。基因工程药物应证实最终制品中无外 源病毒和细菌等污染。 热原质可用传统的注射家兔法进行检测。 目前鲎试验法测定内毒素。 必须用敏感的方法来测定来源于宿主细胞的残余DNA的含量。,6.稳定性考察 药品的稳定性是评价药品有效性和安全性的重要