南宁无创产前检测(NIPT)会议课件 NIPT实验流程与技术细节介绍-孙阳

NIPT实验流程及关键质控环节孙阳yangsun@熟悉几个基础概念胎儿DNA浓度低Q值URZ值GC含量（GC偏移）熟悉几个基础概念1.

含量低：在孕妇血液中包含母亲和胎儿的游离DNA，其中胎儿的游离DNA仅占血浆游离DNA总量的3%~20%。2.

片段化：胎儿游离DNA片段较小，从75bp~250bp不等，平均为166bp。3.

半衰期短：分娩后母体静脉血的胎儿游离DNA在2小时左右快速降解消失。熟悉几个基础概念Extract

andPrepare

cfDNANext-Gen

DNASequencing熟悉几个基础概念NOT

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Human

GenomeMillion

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sample熟悉几个基础概念FetalCountingNOT

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SCALEcfDNA(20%)10%

moreChr21cfDNA

inT21MaternalcfDNAVS……Chromosomes:12321Trisomy

21Q值测序准确性Q10

准确率90%Q20

准确率99%Q30

准确率99.9%%>=Q3096.1%Q30比例测序准确性%>=Q3096.1%该批次测序数据中，96.1%的碱基准确率达到了99.9%Z值GC含量(GC偏移）检测流程NIPT17样本采集保存结果审核报告发放NIPT实验流程－血浆分离1.

含量低：在孕妇血液中包含母亲和胎儿的游离DNA，其中胎儿的游离DNA仅占血浆游离DNA总量的3%~20%。2.

片段化：胎儿游离DNA片段较小，从75bp~250bp不等，平均为166bp。3.

半衰期短：分娩后母体静脉血的胎儿游离DNA在2小时左右快速降解消失。NIPT实验流程－血浆分离采血管的选择先验证，后使用NIPT实验流程－血浆分离

目的从外周血中得到上层血浆cfDNANIPT实验流程－血浆分离

方法两步离心低速离心高速离心1600g,10-15min16000g,10min5-10mL外周血细胞分层血浆样本NIPT实验流程－血浆分离NIPT质量控制－血浆分离

常见异常情况溶血√×脂血凝血××NIPT质量控制－血浆分离质控点结果影响脂血、溶血、凝血胎儿浓度低、建库失败数据库不匹配、GC偏移不同采血管的存放温度和时效性动作轻柔，避免吸到白膜层胎儿DNA浓度下降、重抽血率上升无法重复检测、医患纠纷建议分装3-4管无法重复检测结果、医患纠纷分离后血浆的保存NIPT实验流程－DNA提取血浆DNANIPT实验流程－DNA提取

目的

方法从血浆中获得游离的cfDNA磁珠法过柱法原理：表面带有特定活性基团的磁珠特异性的吸附血浆中游离DNA分子pH原理：在高盐低

的条件下将裂解后的DNA到DNA吸附到硅胶膜上，随后用低盐洗脱液得便于实现自动化NIPT实验流程－DNA提取弃上清收集沉淀弃沉淀收集上清加液弃液NIPT质量控制－DNA提取温湿度控制NIPT质量控制－DNA提取

质控点

加入质控体系：质控整个检测系统，全程参与DNA提取、文库构1例阳性质控品/批次建、上机测序到数据分析过程1例阴性质控品/批次参与DNA提取、文库构建、文库质控过程，质控1例空白水对照/批次实验过程是否存在污染NIPT质量控制－血浆分离、DNA提取质控点结果影响脂血、溶血、凝血胎儿浓度低、建库失败数据库不匹配、GC偏移不同采血管的存放温度和时效性胎儿DNA浓度下降、重抽血率上升动作轻柔，避免吸到白膜层无法重复检测、医患纠纷建议分装3-4管无法重复检测结果、医患纠纷无法监控检测全程分离后血浆的保存在血浆分离时加入质控品一阴、一阳、一空白每个操作批次都要添加假阳、假阴、污染环境温湿度控制建库失败、GC偏移检测流程NIPT1234567样本采集保存血浆分离DNA提取文库构建文库质控上机测序数据分析结果审核报告发放NextGenerationSequencing:A

Paradigm

Shift125,000

machines1

(uno)machineNow…1

labbench1

NSQ550ARThen…1

guy

(withsideburns)150G

bases/day/instrument￥160-200

for

1Gb

raw

data1.2

Mbases/day/instrument￥10-20M

for

1Gb

raw

dataData…2005

–

50Gb2008

–

2,500Gb2009

–

200,000Gb…………Genbank

2005

–

50

GbData…2005

–

50Gb2008

–

2,500Gb2009

–

200,000GbIllumina

GA2008

–

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GbIllumina

GA2009–

200,000

Gb2005

–

50Gb2008

–

2,500Gb2009

–

200,000GbToday……NIPT实验流程－文库构建样本唯一识别序列123NIPT实验流程－文库构建

目的

方法DNA片段两端连接所需的接头，用于上机测序末端修复加接头磁珠纯化磁珠纯化磁珠纯化PCRNIPT质量控制－文库构建

质控点程序温度选择仪器定期校准NIPT质量控制－文库构建

质控点标签引物（同批次测序样本不能使用相同的标签）用多少剪多少

用完封膜NIPT实验流程－文库构建样本唯一识别序列NIPT质量控制－DNA提取温湿度控制NIPT实验流程－文库构建

方法PCR扩增PCR-free

末端修复

加接头

扩增末端修复加接头接头NIPT实验流程－文库构建不扩增正常扩增NIPT质量控制－文库构建质控点结果影响建库失败、GC偏移仪器定期检定校准Index正确选择样本混淆建库失败环境温湿度控制NIPT实验流程－文库质控文库构建上机测序NIPT实验流程－文库质控

目的

方法在给定的判定标准基础上，检测文库是否符合上机测序要求两个方面质文库片段大小有无杂峰量确定文库浓度Qubit2.0/3.0QPCRAgilent

2100CaliperNIPT实验流程－文库质控•DNA从孔道表面进入毛细管向前迁移，DNA双链小沟结合凝胶里的荧光集团进样分离检测•电流方向改变，部分DNA向中心检测孔道迁移•电压增大，不同片段大小的DNA移动速度不同，分子小的迁移较快•荧光染料与DNA双链小沟结合，发出荧光•不同大小的DNA分子先后通过激光探头，且荧光激发被检测微流控技术质一次可检测12例样本，低通量一次可检测96例样本，高通量NIPT实验流程－文库质控2100峰图Caliper峰图NIPT实验流程－文库质控原理：Qubit®

3.0荧光计采用专门研制的荧光检测技术，荧光染料可与双链DNA特异性结合，发出荧光信号。跟据荧光信号的强弱可测定样本浓度。量原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。NIPT实验流程－文库质控操作简单，易掌握单样本检测检测速度快PCR方法NIPT质量控制－文库质控

质控点定量不准会直接导致样本测序数据量波动，影响结果可靠性NIPT实验流程－Pooling

目的是将不同的

文库按照一定的规则进行混合，将混合后的DNAPoolingpooling文库进行上机测序，从而降低测序成本，提高测序通量。

方法123N在相同数据量的需求下，浓度大的文库取样体积小，浓度小的取样体积大。简易理解为“数据量/浓度”……具有相同标签引物（Index）的文库不能混在一个Pooling一定的体积中Pooling文库NIPT质量控制－文库质检、Pooling质控点结果影响数据量不足、UR不足数据量不足、UR不足质-无杂峰、片段大小正确量-定量准确Index选择正确、操作、计算准确样本混淆、数据量不足NIPT实验流程－上机测序

仪器选择测序准确性功能拓展性测序通量仪器稳定性操作简便性仪器选择测序速度NIPT实验流程－Illumina可逆终止子双通道SBS簇生成测序NIPT质量控制－上机测序

质控点NIPT实验流程－上机测序测序准确性Q10

准确率90%Q20

准确率99%Q30

准确率99.9%NIPT质量控制－上机测序

质控点熟悉几个基础概念NOT

TO

SCALEAlignmentCount:AGGTACCGATGACTTCCAGGCGAT

T

TAACT…ACCACGATTTAACTGGAGTAAAGACTTCCAGGTACCGATCTAGCCT…

Human

GenomeMillion

of

“counts”

per

sampleNIPT质量控制－上机测序

质控点Unique

reads：唯一比对到基因组上的序列数。GC含量：基因组A、T、G、C4种碱基，G和C所占的比例。母体CNV母亲携带的CNV会对胎儿染色体非整倍性的计算带来巨大影响原始的Z值结果系统修正后结果样本数据库拟合线如果能够过滤母体CNV，能够有效排除母体胎盘嵌合或孕妇本人染色体异常对胎儿检测结果的干扰，从而有效降低假阳性率。NIPT质量控制－上机测序、数据分析质控点结果影响比对不准确、结果错误可用数据少，结果错误Q值UR足够GC含量合理母体CNV数据偏移，结果错误假阳性检测流程NIPT17样本采集保存结果审核报告发放NIPT质量控制－血浆分离、DNA提取质控点结果影响脂血、溶血、凝血胎儿浓度低、建库失败数据库不匹配、GC偏移不同采血管的存放温度和时效性胎儿DNA浓度下降、重抽血率上升动作轻柔，避免吸到白膜层无法重复检测、医患纠纷建议分装3-4管无法重复检测结果、医患纠纷无法监控检测全程分离后血浆的保存在血浆分离时加入质控品一阴、一阳、一空白每个操作批次都要添加假阳、假阴、污染环境温湿度控制建库失败、GC偏移NIPT质量控制－文库构建质控点结果影响建库失败、GC偏移仪器定期检定校准Index正确选择样本混淆建库失败环境温湿度控制NIPT质量控制－文库质检、Pooling质控点结果影响数据量不足、UR不足数据量不足、UR不足质-无杂峰、片段大小正确量-定量准确Index选择正确、操作、计算准确样本混淆、数据量不足NIPT质量控制－上机测序、数据分析质控点结果影响比对不准确、结果错误可用数据少，结果错误Q值UR足够GC含量合理母体CNV数据偏移，结果错误假阳性其他测序平台实验流程简介NIPT实验流程－文库构建•

文库构建原理及流程末端修复磁珠纯化接头连接PCR扩增文库DNA磁珠纯化磁珠纯化NIPT实验流程－Proto