RNA研究进展.ppt

1、RNA研究进展,一、RNA研究的历史回顾,RNA研究的早期历史：19世纪的80年代20世纪初，解决了核酸的组成和核苷结构。 (Kossel及其学生),上世纪50-60年代，揭示了RNA的翻译功能 发现了tRNA、rRNA、mRNA，破译了遗传密码，基本搞清了RNA将遗传信息从DNA传递至蛋白质的途径。,第一个高潮：,上世纪80年代开始形成的，揭示了RNA的催化和调控功能 1981 T.Cech发现四膜虫rRNA前体的自我拼接，称为ribozyme。 1983 R.Simons等以及T.Mizuno等发现反义RNA。 1986 R.Benne等发现RNA编辑(editing)。 1990-199

2、8 出现了RNAi技术,第二次高潮:,RNA种类不断增加，具有全部DNA和蛋白质的生物功能： 携带遗传信息(病毒RNA) 催化活力(Ribozyme) 调控功能(反义RNA、ppGpp、oxy SRNA、某些抑癌基因、调控X染色体活性的Xist) 运动功能(pRNA)、信使功能(cAMP) snRNAmRNA剪接、snoRNArRNA成熟加工,gRNARNA编辑 SRP-RNA蛋白质的分泌 端粒RNADNA端粒合成并影响细胞的寿命 tmRNA破损mRNA蛋白质合成的终止等。尚有很多RNA的功能还未鉴定， 如很多scRNA(细胞质小分子RNA)、用沉降系数命名的7S, 10S RNA等。 估计:

3、 生物体内RNA基因数相当于蛋白质基因数,真核生物体内，一个由RNA组成的调控DNA遗传信息的网络正在显露出来。从古老的RNA世界走出的自私的RNA，通过各种途径，最终仍然掌控遗传信息的管理和使用权。与其说RNA将携带遗传信息的功能交给了DNA ，不如说RNA把记录遗传信息的职责交给了DNA 。一个隐藏在表象为DNA-蛋白质世界后面的当代RNA世界的景象，已经若隐若现地出现在人们的面前。,RNA组学（RNomics）2000年,新的RNA及其基因的寻找； 新的RNA功能研究； RNA时空表达谱的建立及其生物学意义研究； RNA组学的研究方法（高通量）,百年中RNA研究的诺贝尔学奖,Kossel

4、发现4种碱基1910年诺贝尔生理与医学奖。 Ochoa纯化PNP酶并用它合成了高分子RNA1959年诺贝尔生理与医学奖。 Holley测定第一个核酸(酵母丙氨酸tRNA)的一级结构，Khorana和Nirenberg破译遗传密码1968年诺贝尔生理与医学奖。,Sutherland发现作为第二信使的cAMP1971年诺贝尔生理与医学奖。 Temin和Baltimore反转录酶1978年诺贝尔生理与医学奖。 Altman和Cech发现RNA具催化活力1989年诺贝尔化学奖。 Robert和Sharp发现断裂基因(与RNA剪接有关)1993年诺贝尔生理与医学奖。 Andrew Fire和Craig

5、Mello (RNA干扰机制双链RNA沉默基因)-2006诺贝尔生理与医学奖,RNA研究的论文刊物,二、 RNA组成与结构多样性功能多样性,1、 RNA组成的多样性 近100种修饰核苷酸（DNA中10种） 大量修饰核苷酸对RNA结构和构象产生很大的影响，能改变对蛋白质的识别及生物功能 碱基配对比DNA复杂,2、 RNA有多种二级结构 单链无规则线团、双链结构、发夹结构、突环、两茎连接、四茎连接,三级结构： 假结结构、三链结构、环-环结合、螺旋-环结合,三、 RNA的分类：,RNA,编码蛋白mRNA,调控RNA,非编码蛋白RNA,持家RNA,持家RNA：在生命活动过程中，长期恒定表达，其功能是维

6、持基本生命所必需的。 调控RNA： 表达有时空特异性，常常是短暂表达； 在生物的不同层面上调控； 如不同的发育分化阶段、不同性别、不同组织与细胞系、不同生理状态调控。 常与生物的适应性反应及应急性反应有关。,51,52,四、RNA生物功能的多样性：,1、RNA在遗传信息的翻译中起着决定的作用 mRNA 信使(messenger)和模板(template) tRNA 转运(transfer)和信息转换(adaptor) rRNA 装配 (assembler)和催化(catalyst),延伸,1992年,Holler证明转肽反应是由核糖体大亚基rRNA所催化,核糖体蛋白质被认为只起辅助作用,2、R

7、NA具有重要的催化功能（核酶）及其他持家功能（housekeeping function）,核酶(Ribozyme),1）1981年Cech 等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制发现自我催化，且 L-19（395核甘酸）有催化作用 2）1983年Altmam和Pace两家实验室研究核糖核酸酶P（RNaseP）发现其中M1 RNA具有核糖核酸酶活性,Cech小组 四膜虫的26s rRNA,几分钟内切去413nt的内含子片断,成熟的rRNA （Interveming Seguence） IVS 间插序列片断,上述整个过程在没有任何蛋白质和酶的情况下进行,rRNA前体（不稳定）,L-19 395核甘

8、酸,15核甘酸,L-19 IVS 具有高度的专一性 服从Michaelis-Menten动力学规律 Km42106 M （C5为底物） kcat33103 s-1 kcat/Km= 103 s-1M 与RNase A极其相似 脱氧C5是其竞争性抑制剂 K i=26010-6 M -经典酶催化作用特征,催化功能：,核酸内切酶和连接酶活性 核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、RNA限制性内切酶、 磷酸转移酶、氨基酸酯酶、氨酰-tRNA合成酶和氨酰酯酶等。 核酶的Km 值较小, 即与底物特异结合的亲和力高; 转换数较低, 催化速度较低。,核糖核酸酶P(E.coli),tRNA 5端成熟tRNA RNaseP

9、蛋白质(非活性) RNA (活性20mMg2+) RNaseP中的RNA组分及RNaseP中RNA组分的前体 RNA具有核糖核酸酶活性,分子间催化(核酶复合物),核糖核蛋白复合物RNaseP, 端粒酶 核糖体（肽基转移酶）、拼接体、编辑体、信号识别颗粒 （复合物中RNA单独有催化功能）,分子内催化,RNA合成后的加工（自我切割、拼接、环化）,其他持家功能（housekeeping function）,tmRNA破损mRNA蛋白质合成的终止 gRNARNA编辑,tmRNA类似tRNA和mRNA (tRNA-like domain) 5和3末端序列有一个类似丙氨酰tRNA的结构， mRNA 中间序

10、列编码标记肽(tag peptide),tmRNA兼有tRNA和mRNA的双重功能，在细胞中参与一种特殊的翻译反应反式翻译反应(trans-translation)，结果形成一个在C-末端接有一个标记肽的嵌合蛋白质,功能,(1) 将“滞留”在mRNA上的核糖体解脱下来. 使其加入到下一轮蛋白质的合成 (2) 将一段信号肽加在有缺陷的蛋白质C末端,使其有效的水解细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的物质基础之一,RNA编辑,RNA编码序列的改变称RNA编辑 （editing）,RNA编辑的发现,DNA正链序列 GA G A A mRNA序列 GAU UGU AUA 蛋白质序列 Asp Cys Il

11、e 锥虫co基因与其表达产物的序列比较,后果,mRNA前体产生多种蛋白 tRNA反义密码影响蛋白质一级结构 rRNA通过RNA分子内部和分子间的相互作用，改变的稳定性及在细胞内的分布,2、RNA编辑的类型：,1） 多个U的添加和去除 2） CU的转变 高等植物线粒体RNA编辑、叶绿体mRNA的编辑、载酯蛋白BmRNA编辑 3）粘菌线粒体转录物中单个C的添加 4）AI（或G），UG（或A）的转变 5）核苷酸的共转录添加 6）3/端多聚腺嘌呤化产生终止密码子,RNA的编辑-gRNA的作用,g,g,g,RNA编辑的意义,可以消除移码突变等基因突变的危害 增加了基因产物的多样性 还和生物发育与分化有关

12、，是基因调控的一种重要方法。 RNA编辑还可能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化 RNA编码还可能与学习和记忆有关,3、RNA转录后加工和修饰,切割、修剪、修饰、异构、附加、拼接、编辑和再编辑特殊RNA（与蛋白质形成的复合物）参加 snRNAhnRNA转录后加工、拼接,snoRNA核仁中的小RNA,（总和已达240余种） 一种是独立转录的基因，内含子中片段加工而成 参与rRNA前体加工 rRNA中2-O-核糖的甲基化修饰 rRNA中尿嘧啶向假尿嘧啶的转换 RNA伴侣-参与了rRNA高级构象的形成过程 （推测）,4、对基因表达和细胞功能的调节作用,反义RNA改变靶部位构象影响其功能 m

13、icRNA可调节mRNA的翻译 oxySRNA抗氧胁迫，多效，抗突变 roX1RNA激活雄性X染色体转录活性 XistRNA哺乳类雌性两性X染色体之一失活,5、RNA在生物进化中起重要作用,生命起源问题深入研究,蛋白质,核 酸,？,？,三、RNA应用技术,核酶 反义RNA RNAi,核酶应用剪刀基因,A）改造核酶罕见的RNA限制性内切酶，用于生物学研究 B）对遗传病、癌症和病毒性疾病，给予基因的治疗 锤头结构，发夹结构,进展及问题,乙肝病毒、丙肝病毒、A型流感病毒、乳头瘤病毒、肿瘤、显性遗传病锤头结构 艾滋病病毒发夹结构 切割效率太低 Ribizyme是RNA分子，易为RNase所破坏，给药途

14、径有待研究,反义RNA的概念 反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。这种反义RNA通过与靶RNA碱基配对结合的方式参与基因表达的调控。 通常把转录产生反义RNA的基因称为反义基因或反义DNA。,反义RNA的作用原理,有义DNA,信使RNA,有义DNA,反义DNA,反义RNA的应用,1）反义技术在农业上的应用 2）反义技术在医药方面的应用 3）反义技术在分子生物学研究上的应用,RNAi(RNA Interference)技术,2002年,RNAi被science评为最重要的科学进展之一,Andrew Fire和Craig Mello (RNA干扰机制双链RNA沉默基因)-2006诺贝尔生理与医学奖,简单定义：由双链RNA来降解RNA，从而抑制RNA转录后的翻译，使得相应基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTCG)的一项技术。,mRNA,dsRNA,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性和保护机制.,RNAi Mechanism,RNAi 作为一种研究工具,优点：High Specificity：perfect match,H