《发酵工程》第3章 培养基的制备与灭菌.ppt

1、第三章 培养基的制备,教学内容(4学时)： 了解培养基的营养成分，掌握培养基的类型和用途 了解发酵培养基的选择，了解原料转换的意义 了解淀粉水解糖的制备方法 了解生物合成的前体物质及促进剂,第一节 培养基的原材料,培养基的营养成分 培养基的类型 发酵培养基的选择 原料转换及意义,碳酸气 淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品,一、培养基的营养成分及用途,1.碳源,功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；,有机氮：黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、 酵母粉、鱼粉、发酵菌丝体、酒糟水等 无机氮： 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐,功能：构成菌

2、体、含氮代谢物；,2.氮源,磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐 3.无机盐 铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位；,4.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌酸等 功能：酶的辅助部分，维持生命活动；,5发酵的促进剂与抑制剂 发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂,1）、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素

3、产量可从20u/mL增加到100u/mL，研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限结合到青霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。,2）、促进剂：指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。 比如在酶制剂发酵过程中，加入诱导物、表明活性剂及其它一些产酶促进剂（比如吐温80、植酸、洗衣粉等）,3）、抑制剂：在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。 例如：微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。,6.水分 功能：生化反应均在水溶液中进行,二、培养基的类型,1.依营养物

4、质的来源分类 天然培养基； 合成培养基，也称组合培养基（多用于定量研究）； 半合成培养基，（用的最多，在部分天然有机碳源、氮源、生长因子的基础上，适当加入一些化学药品）；,2.依培养基的物理状态来分： 1）固体培养基 A、凝固培养基 ：即遇热可融化，冷却后则凝固的固体培养基 B、非可逆性凝固培养基：指有血清凝固成的固体培养基或由无机硅胶配成的凝固后即不能再融化的固体培养基 C、天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成的培养基，如麸皮，米糠，木屑等 D、滤膜：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜，把它制成圆片状覆盖在营养琼脂或浸有培养液的纤维衬垫上，形成了具有固体培养基性质的培养条件。,2）半

5、固体培养基 再配置号的液体培养基中加入0.5%左右的琼脂作为凝固剂，形成的培养基称之微半固体培养基。 主要用于菌种鉴定，观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等,3）液体培养基； 培养基中8090%是水。,3.依培养基的用途来分 1）、孢子培养基 2）、种子培养基 3) 、 发酵培养基 4）、补料培养基 5）、加富培养基 6）、选择培养基 7）、鉴别培养基 8）、增殖和保存培养基 9）、富集培养基 10）、测定培养基,三、发酵培养基的选择,一）、配置培养基的原则 1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基 2、注意各营养物质的浓度和配比 3、调节适宜的物理化学条件 4、根据培养微生物的目的配置

6、5、尽量使用廉价易得的原料,1、生态模拟 2、查阅文献 3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方 4、实验比较 实验的规模一般由定性到定量，由小到大。 发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；,二）、配置培养基的方法,发酵培养基的选择程序,要了解生产菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求； 对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等要有所了解 应先以合成培养基为基础，先进行摇瓶试验，再进行小型发酵罐培养，探索此生产菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力,要注意

7、培养过程中的pH值变化，比较适于菌体生长繁殖和适合于代谢产物形成的pH值差异，不断调整 在初步研究的基础之上，先确立一个培养基配比；再进行各种重要的金属和非金属离子的影响试验，试验各种无机盐的最高、最低和最合的用量 在合成培养基的基础上，进行复合培养基试验，探讨各种发酵条件和培养基的关系。 如培养过程中的pH值变化与培养基各种组成的关系。,四、原料转换及意义,1、节约原料，减低单耗，提高发酵单位和总收率； 2、开拓新的原料资源和微生物资源：野生植物淀粉、植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇,日本 1959年开始研究由醋酸发酵生成谷氨酸的工艺，并于1968年由味之素公司设厂制造，为发酵法制造谷

8、氨酸由“粮食发酵”转入“无粮发酵”奠定了基础。,谷氨酸发酵原料：最初用葡萄糖，以后改用淀粉水解糖液或薯粉水解糖液，产糖地区则采用价格低廉的糖蜜为原料,随着石油化工的发展，合成醋酸和乙醇的产量逐年增加，醋酸和乙醇作为一种新型发酵原料，越来越受到重视。近年来，国外乙醇代粮发酵的研究取得了重大进展，除抗生素外，几乎所有用粮食发酵生产的产品，如氨基酸、有机酸、酶制剂、单细胞蛋白、糖类、脂肪、维生素、核酸类物质等，都可以用乙醇为碳源发酵生产。,第二节 淀粉水解糖的制备,一、淀粉水解糖的制备方法 1、酸解法： 定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法. 优点：设备要求简单

9、，水解时间短（20min），设备生产能力大 缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。,2、酶解法：（双酶水解法） 定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：第一步是利用淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。也称双酶法,-淀粉酶（液化） 葡萄糖淀粉酶（糖化） 优点：1、反应条件温和。 2、酶的专一性强，副反应少 3、可在较高的淀粉乳浓度下水解 4、糖液的营养物质丰富 5、糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液

10、的精制 缺点：时间长（23）天，要求的设备多，糖液过滤困难。,3、酸酶结合法 酸酶法 酶酸法,1) 酸酶法,事先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖 玉米、小麦等谷类淀粉，淀粉颗粒坚实，如用淀粉酶在短时间内液化往往不彻底。 酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。 用酸量较少，产品颜色浅，糖液质量高。,2) 酶酸法,先用淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖 有些原料（如碎米淀粉），颗粒大小不一，酸法水解不均匀，出糖率低，故采用先经淀粉酶液化，过滤除杂质后再酸水解 能采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产较易控制，时

11、间短。而且酸水解pH稍高，可减少副产物的形成，糖液色泽较浅。,表2-2 不同糖化工艺糖化质量比较,二、淀粉酸水解理论基础,淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生着：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。 复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。 分解反应：葡萄糖 羟甲基糠醛 有机酸、色素等,淀粉的水解反应,1.淀粉水解过程 颜色变化：蓝色 暗紫 紫 红褐 暗红 红 浅红,水解总趋势: 淀粉糊精低聚糖葡萄糖; 其中葡萄糖单位30-35时遇碘变蓝,随着聚合度的降低,呈现上述颜色变化,2、淀粉酸水解反应动力学,属于单分子一级反

12、应类型： K：反应速度常数，由反应条件（如温度、酸度等）而定 C：淀粉浓度,浓度对时间求导，浓度的降低,3、影响酸水解的因素 酸的种类 主要因素 浓度（酸的浓度、淀粉的浓度） 水解温度,（二）、葡萄糖的复合反应及其影响因素 复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。,影响复合反应的因素： 1、淀粉浓度的影响（用DE值表示葡萄糖纯度）： DE值还原糖/干物质100 2.、酸的影响：,（三）葡萄糖的分解反应及其影响因素,葡萄糖 5-羟甲基糠醛 乙酰丙酸、蚁酸、有色素物质； 影响因素：浓度、温度、pH值；,第三节 糖蜜

13、前处理,一、糖蜜的来源与特点 糖蜜的干物质浓度很高，约8090Bx，含糖量在50%以上，另含5%12%的胶体物质和10%12%灰分，此外产酸细菌多，某些糖蜜还含有较多的生物素。如不进行预处理，则微生物难于生长和发酵。近年来，由于制糖技术提高，糖蜜中糖的含量大大降低，可发酵性糖减少，非发酵性糖增加，胶体物质和灰分也显著增加，因此，糖蜜发酵前必须进行预处理。,一、糖蜜的来源与特点 二、糖蜜前处理的方法 1、加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）：糖蜜加水稀释到500Bx 加入0.20.3浓硫酸，通入压缩空气1h 静置澄清8h，取上清液。,2、加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）： 糖蜜加水稀释到40 加适量

14、硫酸调节pH值到44.5 放入澄清槽加热至8090，通风30min 保温 7080 812 小时，取上清液。,3、添加絮凝剂澄清处理法： 糖蜜稀释至3040 Bx 加硫酸调pH 33.8 加热至90 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），搅拌均匀 静置1小时，取上清液。,三、谷氨酸发酵糖蜜预处理,1.糖蜜预处理法 活性炭处理法 树脂处理法 亚硝酸处理法 2.添加化学药剂处理法 添加青霉素法 添加表面活性剂 添加抗氧剂法 3.追加糖蜜法 4. 营养缺陷型变异株法,第四节 其他原料的处理,一、纤维素及发酵废液的处理 （一）、利用纤维素废料生产SCP 稻草、麦秆、玉米的茎和叶、甘蔗渣、废纸等 流程如下：

15、,纤维原料,粉碎,水解,中和,澄清,过滤,发酵罐培养,分离,废液,种子,营养盐,菌体,浓缩,磨碎,干燥,成品,（二）利用柠檬酸中和滤液生产酵母,酵母菌种,斜面,一级种子,二级种子,离心分离,中和废液,盐酸调pH3.5,发酵,干燥,粉碎,包装,二次废液,用于发酵培养基 的配置等,二、亚硫酸盐废液的处理 （一）亚硫酸盐制浆废液生产酒精和蛋白质 1、亚硫酸盐造纸制浆废液生产酒精 2、亚硫酸盐纸浆废液发酵生产蛋白质 3、亚硫酸铵法非木材制浆废液培养SCP （二）亚硫酸盐废液发酵生产乳酸 三、木屑水解液发酵生产衣康酸,第五节 培养基灭菌,一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用 消毒：指用物理和化学方法杀死物料

16、、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消灭杂菌和防止杂菌污染,二、灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）； 1、干热灭菌法 灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热 主要用于保持干燥的物料、器具等,2、湿热灭菌法 借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。 优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒 2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底 3）蒸汽均有很大的潜热，

17、冷凝后的水分有利于湿热灭菌 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易 缺点：1)设备费用高 2）不能用于怕受潮的物料灭菌,3、射线灭菌 紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线 化学药品灭菌法 （1）第一大类：表面消毒剂 高锰酸钾溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛 37、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类,（2）第二大类：抗代谢药物 化学结构与微生物必须的代谢物类似 例如：磺胺类化合物取代氨基苯甲酸 （3）第三大类：抗生素,三、加热灭菌的原理,1.、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力； 致死温度、致死时间 2、微生物的热致死动力学：对数残留定律

18、,一级反应： 用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率），与N呈线性关系，即： 式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1 ，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。,积分边界条件：N0N；t0=0,式中， 灭菌时间（s）； N0 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）； N 经过灭菌时间后，残存的活菌数（个）。,3、热致死反应的速度常数K K是表达微生物耐热性的特征常数 ，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热,4、灭菌温度的选择 式中 E为菌体死灭反应的活化能（J/mol），它是菌体死灭反应的特征常数，所以，不同菌其热死灭反应的E不

19、同。,四、影响培养基灭菌的其他因素,培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫,五、分批灭菌与连续灭菌,一）、分批灭菌的操作过程（实罐灭菌） 1）培养基的预热 培养基先加热到8090，然后再导入蒸汽升温到120180。 目的：1）防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释 2）防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。 方法：先将排气阀打开,2）培养基灭菌 从各路通入蒸汽（进气口、排料口、取样口），温度升到120130，保温30min,2、分批灭菌的注意事项 1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。 2）排气量不宜过大，以节约蒸汽 3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。 4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。,二）、连续灭菌： 1、连续灭菌优点： 1）可以采用高温短时灭菌； 2）发酵罐利用率高； 3）蒸汽负荷均衡； 4）热效率高； 5）可采用自动控制，降低