植物生理学实验-叶绿体色素的定量测定2009

1、叶绿体色素的定量测定,植物生理学实验,植物体内的叶绿体色素与光合作用有非常密切的关系。植物叶片的叶绿体色素含量常因栽培技术，氮素营养水平、植物种类等不同条件而有很大变化。因此，在肥水技术、育种、丰产性能及植物病理等研究上常有测定的需要。,一、目的意义,叶绿体色素,叶绿素,类胡萝卜素,叶绿素a,叶绿素b,叶黄素,胡萝卜素,3/1,2/1,3/1,植物生理学实验,叶绿素的化学结构,植物生理学实验,胡萝卜素,二、原理 该方法由Anorn于1949年建立。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯-比尔 定律，某有色溶

2、液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即： D=kCL 式中：k为比例常数。,当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得： kD/C 将叶绿体色素利用纸上色层分离方法得到的各种色素（单一纯度的），配成已知浓度的溶液，测定不同波长下的D，就可以计算k值。,植物生理学实验,如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，即光密度的加和性： D总d1+ d2+ d3+.+ dn,植物生理学实验,叶绿素a、b在红光区和蓝紫光区

3、有吸收峰,类胡萝卜素的吸收峰与叶绿素吸收峰在蓝紫光区重合,叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时，计算公式有所不同。 本实验以 96乙醇为例。,植物生理学实验,已知叶绿素a、b的96%乙醇提取液在红光区的最大吸收峰：a665nm；b649nm 根据有色物质的加和性，建立方程组： D665=Ka665 Ca+ Kb665 Cb D649=Ka649 Ca+ Kb649 Cb 将测定的k值常数代入公式，解方程得： Ca（mg/L）=13.95D665 6.88D649 Cb（mg/L）=24.96D649 7.32D665,96乙醇提取,类胡萝卜素的最大吸收峰在470nm

4、 C类=D470/K类470 470nm下，叶绿素a、b都有吸收，一定要减 a、b的消光度值。 K类470 245 计算类胡萝卜素的公式： Cxc(mg/L)=(1000D4702.05Ca114.8Cb) / 245,植物生理学实验,叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰： 663nm和645nm 663nm下，叶绿素a、b的比吸收系数： Ka66382.04 Kb6639.27 645nm下，叶绿素a、b的比吸收系数： Ka645 16.75 Kb645 45.60,80丙酮提取,根据加和性原则列出以下关系式： D663 = 82.04Ca+9.27Cb D645 = 16.7

5、5Ca+45.60Cb 解方程组得： Ca (mg/L)= 12.72D663 2.59D645 Cb (mg/L)= 22.88D645 4.67D663 Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT (mg/L)= Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663,植物生理学实验,由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量： CT (mg/L)=(D6521000) / 34.5,植物生理学实验,在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。80%丙酮

6、提取液中三种色素含量的计算公式： Ca (mg/L)= 12.21D663 2.81D646 Cb (mg/L)= 20.13D646 5.03D663 Cxc(mg/L)=(1000D4703.27Ca104Cb) / 229,植物生理学实验,三、实验材料： 菠菜叶片 材料分： 新生叶（幼叶），功能叶 ； 一组测定幼叶， 一组测定功能叶。,四、操作步骤程序： 1、样品提取； 2、比色测定 3、了解CL-01叶绿素仪,1、样品提取步骤,将组织表面擦净，剪碎于培养皿内混匀 称取剪碎样品0.15g，共3份 加少量石英砂，少许碳酸钙粉， 加12滴管96%乙醇研成匀浆 再加约5ml乙醇研磨至组织变白，

7、 静置13min 过滤到25ml棕色容量瓶中， 残渣冲洗数次 用滴管吸取乙醇，沿滤纸上部边沿 冲洗残存色素，全部洗入容量瓶中 乙醇定容至25ml，摇匀,滤纸用乙醇湿润,转移时防止倒在滤纸与漏斗中间，否则溶液浑浊。 混浊不能比色，重滤!,碳酸钙要少，多则过滤慢， 提取液浑浊,提取时在研钵中加乙醇量要少,为避免光分解，操作时应在弱光下进行,无损转移 始终防止容量瓶倾倒!,植物生理学实验,以96%乙醇为空白，比色测定3份样品的光密度； 波长665nm、649nm和470nm,B126室：分光光度计 型号：22PC,2、测定光密度,波长调节旋钮,样品室,显示屏,功能键,分光光度计的使用：？,测定溶液加

8、到比色杯的2/3初,空白对准光路,透射比,调零键,开盖,空白对在光路上,调100按钮,合上比色池的盖,调模式至吸光度,用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。 如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前须对分光光度计的波长进行校正。 分光光度计的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（57nm），测定的叶绿素a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，a/b比值严重偏小。,分光光度计精度问题,每次须先选择所需波长，再进行其它调节。共需调节3次波长，波长一定看准确！ 倒液时不超过比色杯2/3；推拉杆要轻避免液体溅出；比色杯用擦镜纸擦净；用完后

9、及时洗净。 拉动拉杆时，须掌握好拉杆的档位，确保待测比色杯处于透光位置。 所有测定完成后，比色杯必须从样品室中取出，冲洗后外置保存！ 测定完毕后废液回收(倒入仪器附近的广口瓶),比色测定步骤,选择需要的波长 按“模式”键，调到“投射比” 打开样品仓盖，按“0”键调零 合上仓盖，按“100”键调满度100 按“模式”键，调到“吸光度” 打开样品仓盖，在最外侧杯室中 放入空白液的比色杯，合上仓盖 按“100”键调空白吸光值为零 其它杯室中放入待测溶液，合上仓盖, 拉动拉杆依次测定各待测液的吸光值,测定注意事项,叶绿体色素含量测定记载表,测定日期：,按96乙醇公式分别计算 (用鲜重) 叶绿体色素含量

10、 （mg/g）= (C(mg/L)*V )/w(g),计算组织中各色素的含量,3、CL-01叶绿素仪,原理：通过测量叶片在两种波长 范围（650nm 和940nm) 内的透光系数来确定叶片 叶绿素的相对含量。 用途：可用于无损检测新鲜叶片中 叶绿素的相对含量。 操作方便，测定速度快， 便于田间使用。,CL-01叶绿素仪,1、键的功能 Enter 输入键，接受当前的状态或进行测定； Mode 功能键，按该键显示不同的功能菜单； 2、测定 按住Mode，打开电源开关，首先显示： File=？ Measure 在该菜单下进行测定。夹上叶片按“Enter”测定，同时保存起来，重复测定。,3、菜单的功能

11、和操作 按“Mode”选择不同的功能， 在“Measure”按“Mode”显示： File=？ ？ Statistics（显示当前存储文件的个数和平均值） 再按“Mode”显示： File=？ ？ Previous（此菜单下按“Enter”，显示上一个存储结果) 再按“Mode”显示： File=？ ？ Next（此功能菜单下按“Enter”，显示下一个存储的结果),再按“Mode”显示： File=？ ？ Last（在此功能菜单下按“Enter”，显示最后一个存储结果） 再按“Mode”显示： File=？ ？ Delete Current（此菜单下按“Enter”，删除当前显示结果） 再按“Mode”显示： File=？ ？ Delete All（此功能菜单下按“Enter”，删除所有存储结果） 再按“Mode”显示： File=？ ？ Ca