PCR优化问题汇总

1、PCR优化问题汇总一、 PCR在产物序列中引入了错误？参考见解：1. 聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。2. 循环数太多：降低循环数。3. 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。二、PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象？参考见解：1. 模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。模板的质量是最重要的。2. 抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。3. 提高退火温度，减少非特异性扩增。4. 减少循环次数，减少非特异性扩增。5. 电泳缓冲液时间

2、太长，PH值和盐离子浓度明显改变。6. 电泳时电压不能太高，8V/cm。7. 一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。8. 加样的量过大。过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。9. 制胶过程中胶孔没制好。10. EB没有冲洗干净。11. 模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。12. 非特异反映。引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。13. 电泳液用久了不换，电泳胶脏了 。14. 扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反

3、应造成拖尾。15. 针对以上情况，可以先提高退火温度试试，如果实在不行，再看看引物是不是合适。如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg离子、引物等都可能造成拖尾。先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，逐项试验。引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的 引物，更不可能是它的问题了。先不要加Taq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。检查一下你的dNTP的量够不够。适当减少23个循环试试，可能会有效果。三、

4、PCR结果总是不满意，请问要注意些什么？参考见解：1. 将PCR反应的试管与反应板紧贴。2. 当酶反应混合物以70“热启动”开始循环时，切记在加入酶之后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。3. 不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。4. 对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。5. 没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。6. 泳道中出现

5、模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。7. 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。8. 检查模板和引物的用量。9. 增加循环次数和/或模板DNA的用量。10. 泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高退火温度，但不要超过68。 重新设计引物或设计更长的引物。11. 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多数情况下可以得到满

6、意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。12. 基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为2434个核苷酸，溶点在6068间。使用这类引物可提高PCR

7、反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。13. 变性：第一步变性在94下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94下进行20-30秒），除非模板中富含GC，则95下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。14. 延伸：68-72下进行延伸操作。 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 长片断PCR系统扩增的片断其3-末端带有一个突出的A，因此建议

8、采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 测序时酶的混合物带有35外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。15. 引物设计： 一般长度20-30bp； 至少50%的GC含量； 避免引物二聚体和二级结构； 引物对的Tm值应该接近。四、假阴性，不出现扩增条带？PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。参考见解：1. 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模

9、板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。2. 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴化乙锭。3. 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引

10、物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。4. Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。5. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50

11、ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。6. 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。7. 靶序列变异：比如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或由于靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的

12、。五、出现非特异性扩增带？ PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带？参考见解：非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。六、PCR扩增有时出现涂抹带或片状

13、带或地毯样带？参考见解：其原因往往由于酶的量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。七、克隆PCR产物的最优条件是什么？参考见解：最佳插入片段：载体比需要实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足

14、大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。八、如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？参考见解：1. 涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。2. 转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，

15、共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。3. 如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。4. 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细

16、胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。九、对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？参考见解：1. 连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。2. 插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。3. 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV

17、过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。4. 带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。5. 高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞十、PCR体系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一层水气，需不需要覆盖矿务油？加多少，具体步骤应怎样？参考见解：是否覆盖矿物油，要看你用的是那种PCR

18、仪了，目前新出的PCR仪都用不着加，因为有热盖技术、密封严格，如PE2700，2400，9600，9700等PCR仪，可以看看所用PCR仪的说明书，应该提到的。去除石蜡油比较有效的方法：1。PCR反应之后，把反应管放的-20C，冻上20-30分，石蜡是不会冻住的，等水相结冻之后，拿出管子，迅速把上面的石蜡油吸掉。用一张干净的Parafilm，将反应液点到上面，轻轻移动或提起膜，石蜡油比较粘膜而水相会流开，分开后吸取水相。十一、PCR加样孔上有很亮的条带，但没有产物条带？参考见解：最大的可能性是蛋白质（Taq酶）与产物结合，滞留在加样孔。解决方案，loading buffer加入0.1SDS为了

19、排除其它可能（例如大片段），可以作一个无反应对照，所有条件都一样，就是不上PCR仪器。然后同时跑电泳，看看上样孔内情况。十二、PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的？参考见解1. 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。2. 减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。3. 引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。4. 改变MgCL2(有时KCL)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。5. 模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在

20、PCR混合物中的4d NTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150umol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。十三、PCR产物大约有900bP，哪种测序方法比较好？直接用纯化的PCR产物测序还是克隆到T载体上再测序？纯化PCR产物的方法哪种比较好？参考见解：1. PCR产物直接测序对PCR产物纯度要求较高。体系中不得有杂带，引物二聚体等。另外PCR产物在体系中需达到一定量，

21、一些低丰度的模板，则需通过增加循环数来达到，但循环数太多易出现突变。克隆到T载体上比较好。经典，且利于保存。酶切鉴定后，选取有正确插入片段的克隆，在将此克隆菌种摇过夜，用1.5毫升EP管装菌液，送公司测序。这样的好处是：公司可以自行铺板子保存菌种，如果第一次测序失败，还可以挑菌落继续测。2. 测序的一个反应大约可以测500bp，在T载体多克隆位点两侧有T7和SP6两种测序引物，如果片段小于500bp，只测一端就够了。如果大于500bp，建议采用双向测序，同时测T7和SP6两个反应，然后将测序结果拼接起来。这项可以让公司完成，也可以自己用软件完成（如DNASTAR）。3. 关于纯化PCR产物，建

22、议采用经典的切胶方法。这种方法回收率为50左右。用此法一般都要用酚氯仿抽提，这是从溶液中去除有机胶必需的。这也是造成产物损失的主要步骤。十四、引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。这种情况该怎么处理?参考见解:1. 不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。2. 适当提高退火温度并调整体系中的Mg2+浓度，结合热启动，通常可以有效减少引物二聚体的量。当然，同时也可以减少引物的量，也会有一定的帮助。3. 还可以做套式PCR:即在目的片段两端外面选

23、择序列设计一对引物,这对引物因为没有位置的限制,可以设计的理想一点,扩增出比目的片段稍长的一段后,作为模板用楼主现在的引物来扩增,比直接扩更有效.十五、为什么会产生弥散（smear）条带？如何解决？参考见解： 在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。1. 减少引物的用量。2. 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。3. 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。十六、出现多种扩增产物条带？怎么解决？参考见解：1. 应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。2. 优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。3. 用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第