肉桂醛对4种常见细菌的体外抑菌实验研究_W

1、 Vol.23 No. 4 2013 年第 4 期JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE 检验检疫学刊 肉桂醛对4种常见细菌的体外抑菌实验研究薛京昌1 徐晓怡1 郑海松2(1.常州市疾病预防控制中心 江苏常州 213022；2.安徽出入境检验检疫局)以肉桂醛为研究对象，探讨了肉桂醛对4种常见细菌的体外抑菌效果。结果表明：肉桂醛对大肠 摘要杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的生长均有较强的抑制能力，其抑菌能力随着浓度的增大而增强；肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度(MIC)为0.4g/mL，对枯草芽孢杆菌的MIC为0.3g/mL，对沙门氏菌

2、的MIC为0.2g/mL；肉桂醛在121、60min处理时间内抑菌效果不受影响，稳定性较好。 关键词 肉桂醛；抑菌；防腐剂 中图分类号 R446.5Bacteriostasis Test of 4 Common Bacteria on Cinnamaldehyde in VitroXue Jingchang1, Xu Xiaoyi1, Zheng Haisong2(1.Changzhou Center for Disease Control and Prevention, Changzhou, Jiangsu, 213022; 2.Anhui Entry-Exit Inspection and

3、 Quarantine Bureau)Abstract: Choose cinnamaldehyde for a research object, discuss the bacteriostasis test of several common bacteria on cinnamaldehyde in Vitro. The results showed cinnamaldehyde have an stronger bacteriostasis ability on Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and

4、 Salmonella grow, and the bacteriostatic ability increased with the increase of cinnamaldehyde concentration; The minimal inhibitory concentration(MIC) for Escherichia coli and Staphylococcus aureus is 0.4 g/mL, while the MIC for Bacillus subtilis is 0.3 g/mL and for Salmonella is 0.2 g/ mL; The bac

5、teriostatic effects make no difference when cinnamaldehyde was heated under 121, 60min which indicated that cinnamaldehyde has high heat stability.Key Words: Cinnamaldehyde; Bacteriostasis; Antiseptic结构发生明显变化。袁萍等10报道肉桂油具有较好的抗药性，为在食品的防腐保质研究提供了重要参考。戴向荣等11探索了肉桂醛抑制黄曲霉的机理， 表明肉桂醛能通过损伤黄曲霉细胞质膜而进入细胞，使胞内大分子空间

6、结构改变并且有序的新陈代谢被破坏，抑制了黄曲霉的生长。 本研究以肉桂醛为抗菌抑制剂，分析肉桂醛对4 种常见细菌( 包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)的抑制效果，进一步探讨肉桂醛对这些细菌的最低抑制浓度(MIC)，并对肉桂醛的热稳定性进行探索。 2 材料与方法2.1 材料 1前言肉桂醛(cinnamaldehyde)，化学名称3-苯基-2- 丙烯酸， 又名- 苯基丙烯醛， 学名苯丙烯醛、桂醛、桂皮醛， 其方程式为C 6 H 5 CH CH CHO，分子量为132.161。肉桂醛为无色或淡黄色油状液体，具有浓郁的桂皮芳香、药辛香气2-4 ；在空气中易氧化成桂酸，熔点-7.5 ，

7、沸点253 ( 常压)，相对密度1.046-1.052 ，折光率1.619-1.623，难溶于水、甘油和石油醚，易溶于醇、醚5。在强酸性或者强碱性介质中不稳定，易导致变色，在空气中易氧化。 已有报道肉桂醛有很好的抑制霉菌的效果6， 也可有效的杀灭细菌、大肠杆菌 7 。研究人员对22种条件致病性真菌进行肉桂醛抗真菌作用试验 8，结果表明，肉桂醛对受试菌均具有抗菌作用； 张文娟9 对肉桂醛抗黄曲霉等8种真菌感染进行了研究，表明它不仅具有明显抗黄曲霉等真菌的作用，且经一定浓度肉桂醛作用后观察到细胞超微2.1.1试剂 苯甲醛、乙醛、乙醇、氢氧化钠、无水硫酸镁、苯、盐酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠：

8、除牛肉膏为试剂纯，其余为分析纯，均由国药集团化学试剂有限公司提供。 50 2013 年第 4 期 Vol.23 No. 4检验检疫学刊 JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE 2.1.2菌种 大肠杆菌（Escherichia养48h，放置备用。 coli，ATCC8739）、2.2.4菌悬液制备 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、金黄色葡萄球菌（ S t a p h y l o c o c c u s aur eu s ， A T C C 6 5 3 8 ） 、 沙门氏菌（ S a l m o n e l l a ， ATC

9、C14028）：均为广东环凯微生物科技有限公司提供的磁珠菌种。 将活化的菌种用无菌生理盐水稀释配制成不同浓度的菌悬液，根据麦氏浊度单位(MCF)用细菌浊度仪测量配制菌悬液的浓度， 活菌数为106-108 个/mL，放置备用。 2.2.5滤纸片制备 2.1.3选取吸水性好的优质滤纸（由北京赛为思生物技术开发中心提供，批号20120308）若干，用打孔器打成直径为6mm的圆形滤纸片，用干热灭菌法灭菌后备用。 2.2.6 肉桂醛抑菌实验12吸取0.1mL的菌液，用涂抹棒均匀涂布在营养肉汁琼脂培养基表面，用无菌镊子分别夹取已浸入的不同浓度肉桂醛溶液的纸片，贴在含菌的培养皿上，每个培养皿相同位置放置4片

10、滤纸。盖上培养皿，放置于37恒温培养箱中培养48h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈的直径(mm)，取其平均直径，即为该药对细菌的抑菌结果。 2.2.7 肉桂醛最低抑菌浓度实验13根据肉桂醛的抑菌实验结果，再配制不同浓度的肉桂醛溶液，按2.2.5方法进行肉桂醛最低抑菌浓度实验，以各自不生长上述4种菌的肉桂醛最低浓度为最小抑制浓度(MIC)。 仪器与设备 SHP-250型微生物生化培养箱：上海三发科学仪器有限公司；SW-CJ-1D型净化工作台：苏州净化设备有限公司；SYQ- DSX- 280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海博泰实验设备有限公司； WGZ-2- XJ细菌浊度仪：上海昕瑞仪器仪有限公司。

11、 2.2 方法 2.2.1 肉桂醛制备4在装有搅拌器、温度计、滴液漏斗和球形冷凝管的250mL 四口烧瓶中，加入120mL NaOH(1%)溶液、20mL乙醇(95%)、5g苯甲醛， 开始搅拌；从滴液漏斗中逐滴加入30%乙醛溶液30g，利用水浴控制反应温度；在反应过程中， 溶液颜色由白色逐渐变成浅黄色，最后呈深黄色；乙醛滴加完毕后，保持反应温度继续搅拌1h ；搅拌完毕后，反应液移至分液漏斗中，分出有机层，用0.5mol/L盐酸调节pH为7.0 ，加入无水硫酸镁干燥；过滤后，将残留物进行减压蒸馏，先蒸出苯甲醛( 沸点62)，后蒸出肉桂醛( 沸点130)；用阿贝折光仪测定产品的折光率为n=1.62

12、1，说明合成的肉桂醛良好。 2.2.8肉桂醛的热稳定性实验 将不同浓度的肉桂醛溶液于121的湿热条件下处理10、20、30、60 min后，按2.2.5方法测定其抑菌效果，以细菌的生长状况为判断标准。 2.2.2培养基制备 营养肉汤： 蛋白胨10g ，牛肉膏3g ， Na Cl2.2.9判定标准 5g，调节pH为7 .0 - 7 .2 ， 定容至1L， 121 高压灭菌20 min。营养肉汁琼脂： 蛋白胨5g， 牛肉膏30g，NaCl 5g，琼脂15g，调节pH为7.0-7.2，定容至1L，121高压灭菌20min。 标准参照渔用抗菌药物药效试验技术规范14。抑菌圈直径小于10mm为低度敏感，

13、在10-18mm之间为中度敏感，大于18mm为高度敏感。 3 结果与分析3.1 不同浓度肉桂醛的抑菌效果比较 不同浓度肉桂醛对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌生长抑菌圈直径大小见表1。 2.2.3菌种活化 将保藏于菌种保存管的磁珠菌种移取适量到营养肉汤培养基中，于37生化培养箱中倒置培 表1不同浓度肉桂醛抑菌圈大小 不同被试菌种的抑菌圈直径（mm）肉桂醛浓度(g/mL)大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌0.51.02.05.0121315268121423101215288121825 51 Vol.23 No. 4 2013 年第 4 期JOURNAL OF INSP

14、ECTION AND QUARANTINE 检验检疫学刊 表1结果显示，随着肉桂醛浓度增大，抑菌圈直接逐渐增大，抑菌效果越明显。进一步分析表1数据可知， 浓度为0.5 、1.0 、2.0g/mL的肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌程度为中度敏感，浓度为5.0g/mL的肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌程度为高度敏感；浓度为0.5g/mL的肉桂醛对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌程度为低度敏感，浓度为1.0、2.0g/mL的肉桂醛对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌程度为中度敏感，浓度为5.0g/mL的肉桂醛对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌程度为中度敏感。这说明肉桂醛的抑菌效果与该物质的浓度呈正相关

15、性， 随着肉桂醛浓度的增大，肉桂醛对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌抑菌能力越来越强。 3.2 肉桂醛最小抑菌浓度结果 对肉桂醛的最小抑菌浓度进行试验，结果见表2。 表2肉桂醛的最小抑菌浓度结果 不同被试菌种的生长状况肉桂醛浓度(g/mL)大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌0.10.20.30.4+-+-+-+-注：“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长。 表2显示，肉桂醛浓度为0.4g/mL时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不生长； 肉桂醛浓度为0.3g/mL时，枯草芽孢杆菌不生长；肉桂醛浓度为0.2 g/mL时，沙门氏菌不生长。试验结果说明，肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡

16、萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.4g/mL，对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.3g/mL，对沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.2g/mL。 3.3 肉桂醛热稳定性实验结果 以枯草芽孢杆菌为试验菌种，测试不同浓度 的肉桂醛在不同的湿热处理时间下对枯草芽孢杆菌的抑菌效果，结果如表3所示。不同浓度肉桂醛在湿热处理30min后对不同菌种的抑菌效果，结果如表4 所示。从表3可知肉桂醛湿热处理后对细菌的抑菌效果的影响很小，从表4可知不同浓度的肉桂醛经湿热处理后对不同细菌的抑菌效果的影响很小。综合说明，肉桂醛对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌效果受 热的影响很小，其热

17、稳定性良好。 表3肉桂醛的热稳定性实验结果 时间(min)肉桂醛浓度(g/mL)102030600.10.20.30.4+-+-+-+-注：以枯草芽孢杆菌为试验菌种。“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长。 表4不同浓度肉桂醛的热稳定性实验结果 肉桂醛浓度(g/mL)被试菌种0.10.20.30.4大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌沙门氏菌 +-注：“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长。 4讨论（ 1 ） 以1 20 mL Na OH( 1 %) 溶液、20 m L乙醇( 95 %)、5g苯甲醛、30g 30% 乙醛为原料， 在NaOH作为催化剂的条件下，通过羟缩合反应、减压蒸馏

18、，合成肉桂醛。用阿贝折光仪测定其折光 52 率为n=1.621，合成的肉桂醛良好。 （ 2 ） 用滤纸片法测定肉桂醛的抑菌效果可知，肉桂醛浓度在0.5-2.0g/mL之间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌程度为中度敏感，浓度为5.0g/mL的肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球 2013 年第 4 期 Vol.23 No. 4检验检疫学刊 JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE 菌的抑菌程度为高度敏感；肉桂醛浓度为0.5g/ mL 的肉桂醛对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌程度为低度敏感，浓度在1.0-2.0g/mL之间对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌程度为中度敏感，浓度为

19、5.0ug/mL的肉桂醛对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌程度为中度敏感。 （ 3 ） 肉桂醛的最小抑菌浓度实验( MIC) 表明：肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 MIC为0.4g/mL；肉桂醛对枯草芽孢杆菌的MIC为0.3g/ mL；肉桂醛对沙门氏菌的MIC为0.2g/mL。 （ 4 ） 肉桂醛的热稳定性较好， 在121 、60min处理时间内，其抑菌效果几乎不受影响。 防腐保鲜是食品工业必不可少的环节， 可以说，没有防腐剂，就没有食品工业。但目前社会上对防腐剂的认识却不尽相同，主要在于防腐剂对人体都有一定的伤害作用。本研究运用充分的科学实验结果，对肉桂醛可能成为一种新的食品防腐剂做了一定的

20、探索性研究。 参考文献1 张荣, 严之光. 肉桂醛合成条件优化研究J. 化学世界, 1995, 36(8):407-409. 2 林棋, 吕吓强, 何明顺, 等. 微波辐射KF/Al2O3催化合成肉桂醛 J. 福州师专学报, 2001, 2: 013. 3 滕占才, 毕洪梅. 聚乙二醇催化肉桂醛合成方法研究J. 化学与粘合, 2003, 1:32-33. 4 霍红, 冯凌霞. 肉桂醛合成工艺的研究J. 安徽化工, 2002, 2:20-21. 5 刘雪梅. 肉桂醛的制备J. 曲阜师范大学学报(自然科学版), 2005, 2:024. 6 张文平, 傅颖媛, 谢小梅. 柠檬醛、肉桂醛抗曲霉菌作用

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23、守，保证了ETA基因对其他生物的高度特异。采用LAMP 技术对铜绿假单胞菌进行检测，试验结果表明设计的引物特异性高，无假阳性现象出现。同时，将LAMP方法与传统生化鉴定方法进行比较，结果显示，两种方法对样品的检测结果一致。LAMP引物的设计是针对6 个区域设计的，特异性强，灵敏度高；由于添加了环引物，使得LAMP 反应时间大大减少；我们对样品处理方法进行了选择优化，缩短了模板制备的时间，使得整个实验过程能在2 h内完成。同时，使用恒温水浴装置即可完成LAMP反应， 不需要使用昂贵、精密的仪器设备；而且可目测反应体系浊度变化或显色反应进行结果判定，操作简便，检测成本低。传统生化鉴定法一般需要3-

24、4d ， 检测周期长， 试剂种类多，对人员操作要求高。因此，通过传统生化培养鉴定的方法来检测铜绿假单胞菌在时效性上难以满足致病菌快速检测的需求。 综上所述，利用LAMP 技术进行铜绿假单胞菌检测具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低、结果准确等特点，为铜绿假单胞菌的检测提供了新的检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构，亦可尝试作为处理突发公共卫生时的现场检测，有望发展成为简易的常规快速检测铜绿假单胞菌的有效手段。 参考文献1 Sadikot R T, Blackwell T S, Christman J W, et al. Pathogen- host interactions in Pseu

25、domonas aeruginosa pneumoniaJ. Am J RespirCrit Care Med, 2005, 171(11): 1209-1223. 2 Osmon S, Ward S, Fraser V J, et al. Hospital mortality for patients with bacteremia due to Staphylococus aureus or Pseudomonas aeruginosaJ. Cheat, 2004, 125(2):607-616. 3 Iglewski B H, Kabat D. NAD-dependent inhibit

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