项目十六免疫细胞的分离

1、项目十六 免疫细胞的分离一、抗凝血的制备 【实验原理】常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。【试剂和器材】1试剂肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。2器材三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。【步骤和方法】1肝素抗凝法将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115灭菌10min(或11215min)，置-20可保存数月。实验中常用的肝素抗凝浓度为2050

2、U/ml血液，实际当肝素浓度为510U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。2EDTA法常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。EDTA-Na2有效抗凝浓度为12mg/ml血液。3脱纤维法在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放3040粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。4Alsever液抗凝法血液与Aalsever液混合比例为1:11:2。【结果判定】除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应

3、重新制备。【注意事项】1采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。2加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。常采用旋转混合的方法混匀。3抗凝血放4保存。【方法评价】肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。Alsever可较长时间保存血液，一般可保存23周。【临床意义】抗凝血的制备是实验室常用的基本技术之一，在免疫试验及血细胞的检测中被广泛利用，是医学检验专业学生必须掌握的基本技能之一。【思考题】1实验室血液抗凝法有哪些？抗凝的原理如何？2不同抗凝法有何特点

4、？试设想不同试验中应如何选择抗凝方法？ 二、外周血中免疫细胞的分离(Extrication of immunocyte from peripheral blood)(一) 白细胞制备 【实验原理】血液中白细胞的分离方法常用自然沉降法或利用高分子聚合物加速红细胞沉降的方法来分离白细胞。因血液中红细胞的密度比其它血细胞密度大，故红细胞沉降率较快，而且高分子聚合物能使红细胞凝聚成串钱状，加速其沉降，故而从血浆层中可分离到白细胞。只介绍60g/L右旋糖酐沉降法。【试剂和器材】160g/L右旋糖酐取右旋糖酐(dextran，分子量200400kDa)6g，加生理盐水至100ml溶解，115灭菌15min

5、，备用。2其它试剂无Ca2+、Mg2+ Hanks液。3器材试管、吸管、吸头、离心机等。【步骤和方法】 取适量抗凝血加入等量60g/L右旋糖酐，轻轻混匀，直立或45角倾斜，置室温或37 30min。取出血浆层，用无Ca2+、Mg2+ Hanks液洗涤3次，每次2000r/min离心10min。按实验要求配成所需浓度，通常为2106个细胞/ml。【结果判定】 此法分离的白细胞中含60%70的淋巴细胞，同时也含较多的粒细胞、单核细胞、血小板及少量的红细胞。【注意事项】1加速沉降时间不能超过30min，自然沉降时间不能超过60min，否则淋巴细胞也会沉积，使收获率降低。2混杂的红细胞可用NH4Cl溶

6、液溶解，离心去除。3吸取血浆层时，也可将红细胞层上的白细胞层收获，虽然白细胞收获率高，但是红细胞的污染率也增高。【方法评价】加速红细胞沉降的方法除本法之外，还有30g/L明胶生理盐水、35g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量25kDa)生理盐水、或10g/L甲基纤维素等分离方法。这些方法简便，细胞收获率比自然沉降法高。明胶沉降法会增加白细胞粘性，对实验有一定影响。自然沉降法所得细胞损伤最小。【临床意义】沉降法制备的白细胞悬液，可用于许多细胞免疫试验，但是由于悬液中含中性粒细胞、血小板及红细胞较多，因此在淋巴细胞增殖试验、组织配型等试验中不宜使用，否则会使结果出现较大误差，甚至出现错误。也可进一

7、步用于其它免疫细胞的分离。【附】红细胞溶解(NH4Cl)法1NH4Cl溶解缓冲液配制 NH4Cl 8.29g (或8.3g) KHCO3 1.09g (或1.0g) EDTA-Na2 37.0mg 蒸馏水加至100ml，溶解后置28保存。用时用PBS(配制：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO47H2O 2.16g，NaCl 8g，NaN3 0.5g，蒸馏水1000ml；0.01mol/L)或蒸馏水稀释10倍，pH在7.37.4(不在此范围应调整pH)，室温保存，1周内使用，过期作废。2溶解方法(1)按每310ml血液分离的白细胞悬液加入5ml NH4Cl溶解缓冲液比例混合(

8、如直接溶解血液中红细胞应按0.51ml血液加入14ml溶解液比例混合)。(2)置室温35min，然后立刻离心，离心速度10002000r/min，离心时间应小于10min，去上清。(3)用Hanks液(或其它缓冲液、培养液)至少洗涤次，按实验要求配制成所需浓度。注意溶解时间不要超过5min，否则会有部分白细胞破坏；溶解后立刻离心，洗涤。 【思考题】 加速红细胞沉降的方法有哪些？其原理如何？(二) 单个核细胞制备【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法(density gradient centrifugation)。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，人外周血单个核细胞的密度为1.

9、0501.077，而粒细胞和红细胞的密度在1.0801.110。利用密度为1.0770.001的分层液，将待分离的细胞悬液小心铺于其上，经离心后单个核细胞悬浮于分层液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。【试剂和器材】1聚蔗糖-泛影葡胺分层液(密度为1.0770.001) 已有商品供应或自己配制。25g/L台盼蓝配制方法见附录。3肝素250U/ml溶液，用Hanks液配制。4Hanks液。5刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。6水平离心机、显微镜。【步骤和方法】1取静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液抗凝，作白细胞计数和分类计数。之后，再加入等量Hanks液，混匀。2取2ml分层

10、液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2:13:1为宜。3置水平离心机中离心2000r/min 20min。4离心后从离心管底部到液面分为五层，依次为红细胞沉淀层、粒细胞层、分层液层、白雾状单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)，见图3-1。图3-1 聚蔗糖-泛影葡胺分层液离心后外周血细胞分布示意图5用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸出该层，置于另一离心管中。6加入5倍量以上的Hanks液，充分混匀，离心1000r/min 10min。离心后倾弃上清液，再用Hanks液洗涤2次。7用含1020灭活小牛血清的Hanks液或培

11、养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝染色检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判定】 1细胞回收率()分离后所得细胞悬液量(ml)悬液中单个核细胞数/ml/ 原全血量(ml)原全血中单个核细胞数/ml100。2淋巴细胞纯度()分离后淋巴细胞总数/分离后白细胞总数100。【注意事项】1温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(1828)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。2分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。3将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。4分离时的转速与时间应根据不同标本作

12、相应调整。离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或缩短离心时间。【方法评价】本方法操作简便、稳定。细胞回收率达8090，单个核细胞纯度可达95，淋巴细胞约占90%95，细胞活力可达95以上。但其中仍可混杂少量(约10)其它细胞。【临床意义】该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞(主要是淋巴细胞)悬液已能满足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。故在细胞免疫试验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。【附】 聚蔗糖-泛影葡胺分层液的配制(密度1.0770.001) 1用双蒸水将4

13、00g/L葡聚糖(Ficoll，分子量400kDa)溶液或干粉配成60g/L溶液，其密度为1.020。2用生理盐水将600g/L或750g/L泛影葡胺(Urografin)配成340g/L溶液，其比重为 1.200。3取2份60g/L葡聚糖与1份340g/L泛影葡胺混合。4pH应为7.27.4；一般偏酸，可用NaHCO3调整。5用波美比重计测密度应为1.0770.001，如超出1.078，用60g/L葡聚糖溶液调节，如低于1.076，用340g/L泛影葡胺溶液调节。6过滤除菌，或112灭菌15min。置4保存备用，一般可保存3个月。 【思考题】 1为何常用密度为1.0770.001的分层液分离

14、人单个核细胞？ 2利用密度梯度离心法分离人单个核细胞，为何要将血液标本进行适当稀释，并要叠加于分层液上？(三) 淋巴细胞与单核细胞的分离【实验原理】单核细胞有粘附玻璃和塑料表面的特性，而且它的密度与血液中淋巴细胞、粒细胞、红细胞不同，故可利用粘附法或连续密度梯度离心法使单个核细胞悬液中的淋巴细胞和单核细胞分离、制备。此处只介绍平皿粘附法。【试剂和器材】1试剂RPMI 1640培养液(含20灭活新生牛血清)、EDTA液(1mmol/L)。 2器材CO2培养箱(或烛缸)，倒置显微镜(或普通显微镜)、离心机、离心管、 吸管、滴管、玻璃平皿、血球计数板。【步骤和方法】1将聚蔗糖-泛影葡胺分离的单个核细

15、胞洗涤3次，用RPMI 1640培养液悬浮细胞，计数，将细胞浓度调整到(24)106个细胞/ml。2将细胞悬液倾注入足够大面积的无菌平皿中，于375CO2环境中静置2h。3吸取未贴壁细胞，并用预温至37的RPMI 1640培养液洗出未粘附细胞，重复洗涤23次，将这些液体合并，其中含淋巴细胞。 4于平皿中加入10ml EDTA，置37 5CO2条件下温育10 min。再用吸管冲洗，使粘附细胞脱落，游离于液体中，并收集之。此为单核细胞收集液。5将未粘附和粘附细胞收集液分别用RPMI 1640培养液洗涤2次，每次离心1000 r/min 8min6检查细胞活力，计数，按实验要求调整细胞浓度。【结果判

16、定】分类计数判断分离细胞纯度。【注意事项】 1分离的单个核细胞应4保存，温度高，单核细胞易粘贴管壁，使之收获率降低。最好用硅化玻璃试管保存。2若单个核细胞悬液中混杂较多红细胞，应预先用NH4Cl或其它低渗溶解法去除，否则会影响单核细胞贴壁。3延长粘附作用(如12h以上)可提高单核细胞收获率。因为粘附时间短(几个小时)不能使粘附力弱的细胞完成粘附作用；同时粘附的粒细胞不能在培养液中存活，延长时间会使其自行“消亡”。4培养液中血清浓度不宜低于20，因为血清能促进单核细胞粘附；另外，高浓度(20%40)血清可阻止B细胞粘附，从而提高分离纯度。最好用自身血清， 若新生牛血清中存在天然的抗小鼠抗体，在分

17、离小鼠单核细胞时不宜采用；不要用多次冻融的血清。5试验用溶液的pH值应控制在7.2左右，不宜使用HEPES缓冲系统，因为单核细胞对HEPES很敏感。【方法评价】该方法简便，不需特殊设备，是分离淋巴细胞和单核细胞常用方法之一。同时用该法也可用于其它体液(如腹腔液)中巨噬细胞的分离。分离的单核细胞纯度在85以上，可混杂少量淋巴细胞，尤其是B细胞。分离的淋巴细胞纯度比聚蔗糖-泛影葡胺(密度1.0770.001)法更高，但该法更常用于分离单核细胞。【临床意义】不仅淋巴细胞在免疫中有重要作用，而且单核细胞在抗原提呈、调节免疫应答等作用中也扮演重要角色。该法分离的单核细胞、淋巴细胞被用于许多细胞免疫试验，

18、以研究它们的免疫功能、抗肿瘤作用等。【附】 1人外周血细胞在Percoll中的漂浮密度细 胞 漂浮密度(g/ml) 细 胞 漂浮密度(g/ml) 细 胞 漂浮密度(g/ml)红细胞1.0901.110T、B淋巴细胞1.0621.077血小板1.0301.060嗜酸粒细胞1.0901.095NK细胞1.0501.070巨核细胞1.020 1.050中性粒细胞1.0801.085淋巴母细胞1.0431.067淋巴细胞1.0521.077单核细胞1.0501.066注：Percoll是经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶微粒的商品名，是一种密度梯度分离介质。2玻璃器皿的硅化方法(1)将玻璃器皿用清水洗净，浸

19、泡洗液1618h，再用清水和蒸馏水冲洗，烘干。(2)用氯仿或庚烷配制的5二氯二甲硅烷(CH3)2SiCl2浸泡或涂刷,使之均匀涂布，放通风橱内挥发至干。(3)用蒸馏水反复冲洗或180烘烤2h。硅化后的玻璃器皿可用45次，如滴水不能成珠应重新硅化。此时应先进行去硅处理，方法是将玻璃器皿浸泡于95酒精氢氧化钠饱和溶液中1618h，到时用清水和蒸馏水冲洗干净。硅化场所应无灰尘。此方法也可用于硅化处理塑料制品。【思考题】 可利用单核细胞的哪些特性使之与淋巴细胞分离？(四)T淋巴细胞与B 淋巴细胞的分离【实验原理】单核细胞和B细胞能吸附尼龙毛(nylon wool)。因此利用过尼龙毛柱的方法可将淋巴细胞

20、悬液中的T、B细胞分离。【试剂和器材】1试剂Hanks液、新生牛血清。2器材(1)聚乙烯软管(0.619cm)。(2)尼龙毛(进口聚酰胺纤维3d，或国产尼龙3d-6短纤维)。(3)吸管、滴管、试管、剪子、镊子、封口钳、离心机、温箱。【步骤和方法】1尼龙柱的制备(1)称取尼龙毛5070mg，充分拉松散后浸入Hanks液中浸透。国产尼龙毛用0.2 mol/LHCl浸泡过夜，用大量蒸馏水冲洗，彻底去除酸液，然后置37烘干后方可使用。(2)将聚乙烯软管热封口一端成锐角，装满Hanks液。(3) 将浸透的尼龙毛均匀松散地装入管内约35cm (1518mg/cm)，管内应无气泡。可置4过夜或冰冻保存，用前

21、融化。(4)管底剪约2mm开口，使液体呈滴状通过(根据尼龙毛塞得松紧程度及下端开口大小来控制流速，约2ml/10s)。(5)用37预温的10新生牛血清Hanks液洗涤34次，封口，再加入该液使其液面高于尼龙毛上端，立刻加入细胞悬液。2细胞分离(1)将淋巴细胞悬液用含10新生牛血清的Hanks液配制成浓度为1108个细胞/ml的悬液，取0.5ml垂直滴加，并使细胞悬液完全进入尼龙柱中。(2)于柱液上端加入0.5ml含10新生牛血清的Hanks液以防干涸，封开口，水平放置37温育4560 min。(3)用25ml 37预温的含10新生牛血清的Hanks液洗柱，收集最初5ml洗脱液，其中含大量T细胞

22、，其余20ml废弃。 (4)一边用手轻轻挤压尼龙柱管壁，一边用5ml含10新生牛血清的冷Hanks液洗柱，洗脱液中富含B细胞。(5)将所得T、B细胞悬液分别离心，倾弃上清液，用适当液体重新悬浮，计数，备用。【结果判定】对T、B细胞悬液分别计数。T、B细胞比例应为5:15:2，如B细胞含量过多，说明可能被T细胞污染，或用荧光抗体法鉴定T、B细胞纯度。本法分离的T细胞纯度为80%90，B细胞可达70%85。细胞存活率在90以上。【注意事项】 1尼龙柱装的质量对分离效果影响较大。尼龙毛应疏松，不能打结、成团或有气泡，否则T细胞不能完全洗出。冲洗时流速不能太快或太慢，以液滴快速自然滴下，但不能连成线为

23、准。2加入的淋巴细胞数量不能超过1107/10mg 尼龙毛，否则T细胞纯度不够；但也不能太少，而使回收率降低。 3试验用新生牛血清(或AB型人血清)均应56 30min灭活。洗脱液中一定要含一定浓度的血清，一般以10% 20为宜，含量太高可使细胞凝聚。适当增加洗脱液量也可减少T细胞污染，要求最后一滴洗脱液中无淋巴细胞。4挤压尼龙柱时，一定要使柱内充满液体。用力不可过大，以免损伤B细胞及把吸附更强的单核细胞洗下，用力过轻使B细胞收获率降低。5冲洗尼龙柱时注意洗脱液与柱温应保持一致。如温度过低，吸附的细胞易脱落，不仅会影响T细胞的分离纯度，也会减少B细胞的收获率。 6分离的淋巴细胞悬液应防止红细胞

24、混入，也应尽量避免粒细胞、血小板及单核细胞污染，否则会影响分离效果或实验结果(如细胞毒试验中，粒细胞容易死亡而产生假阳性结果)。【方法评价】本法快速、简便、重复性较好，分离的T、B细胞纯度高，活力好，以T细胞尤为理想。分离的B细胞也比SRBC玫瑰花环方法制备的具有更好的分型反应。因此是分离T、B 细胞普遍采用的方法。【临床意义】分离的T、B细胞在细胞毒试验、组织分型等试验方法应用较多，也可用于T、B细胞免疫功能方面的研究。 【思考题】 T、B淋巴细胞分离的方法有哪些？其原理如何？ 三、动物组织中免疫细胞的收集(Extraction of immunocyte cell from animal

25、tissue) 【实验原理】淋巴细胞除存在于外周血中之外，主要分布于骨髓、胸腺、淋巴结、脾脏和扁桃体中。不同功能的淋巴细胞在不同淋巴器官中的分布数量是不一样的，多能干细胞主要存在于骨髓中，未分化和未完全分化的T细胞主要分布于胸腺中，成熟的T、B细胞在淋巴结、脾脏中存在数量较多，可根据实验要求采集。此处仅介绍小鼠骨髓、胸腺、脾脏和淋巴结细胞悬液的制备方法。【试剂和器材】1无菌室、超净工作台、离心机、显微镜。2剪刀、手术刀、镊子、注射器及针头、平皿、试管、吸管、钢网(100 200目)。3含5新生牛血清的Hanks液，氯化铵溶解缓冲液。4小鼠【步骤和方法】(一) 骨髓细胞悬液的制备 1用颈椎脱臼法

26、将小鼠处死，消毒。取小鼠股骨和胫骨，将肌肉剥离去除。2将股骨或胫骨一头剪掉，另一头插入注射针头，用注射器吸取Hanks液多次冲洗骨髓腔。3收集冲洗液，离心800r/min 10min，去上清。4重悬浮细胞，计数，按要求调整细胞浓度。(二) 胸腺淋巴细胞悬液的制备1取36周龄小鼠，将之处死。2用75%酒精消毒颈部和胸部皮毛。剥离皮肤，最露胸腔。于第5肋间胸腔中线处剪开，沿切口向上剪至胸骨柄上部。缓慢分离切口边缘，可见胸腺左右叶盖在纵隔胸膜下面。用镊子夹住胸腺下端，另一镊子夹胸腺成反折位，逐渐由下而上摘除胸腺。3剥离去除非胸腺组织，如脂肪、结缔组织、血块等。4将胸腺置于预先已加入35ml Hank

27、s液无菌平皿中的钢网上，用注射器栓挤压使细胞分离。 5自然沉降5min，弃去沉淀物，收集细胞悬液。离心800r/min 10min，去上清，重悬细胞，计数，按实验需要调至所需浓度。(三) 脾和淋巴结细胞悬液的制备1将小鼠处死，消毒，将腹部皮肤剥离。2剖腹，取出脾脏和肠系膜淋巴结，剥离去除非淋巴组织。3按胸腺细胞悬液制备程序收获细胞悬液。4离心去上清，使细胞松散，加入2ml氯化铵溶解缓冲液溶解红细胞。离心，洗涤，计数，按实验需要调至所需浓度。【结果判定】 1每只小鼠骨髓可收获(5060)106个细胞。2每只小鼠胸腺可收获(100200)106个细胞，细胞存活率达90以上。3每只小鼠脾脏可收获(1

28、00200)106个细胞，细胞存活率达8090以上。4每只小鼠肠系膜淋巴结可收获(50100)106个细胞，浅表淋巴结可收获10106个细胞，存活率达80 90以上。【注意事项】1制备培养用的细胞，全部制备过程均应无菌操作。2应用挤压不要用研磨的方式来分离细胞悬液，动作应轻柔，以保证细胞活力良好。3胸腺细胞数随小鼠年龄增长而减少： 26周龄小鼠可获200106个淋巴细胞。 616周龄小鼠可获1106个淋巴细胞。 4个月以上的小鼠可获0.5106个淋巴细胞。【方法评价】自动物淋巴器官中分离淋巴细胞，方法简便，细胞收获量大。可从不同淋巴器官中分离不同功能的淋巴细胞或其它免疫细胞。【临床意义】由于各种免疫细胞的分布、分化程度及功能在动物的不同淋巴器官和组织中是不同的，从中制备的细胞悬液可用于许多不同的免疫学研究和检测中，因此这些制备方法在实际工作中被广泛采用。 【思考题】 1不同动物组织中免疫细胞的分布有何特点？ 2根据实验要求应从何种动物组织中分离诸如干细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞更为适宜？四、活细胞检测(Viable cell counting)【实验原理】某些染料能渗入死细胞内使之着色，但不能渗过结构完整的活细胞膜，从而不被着色。借此在显微镜下能鉴别细胞死活，并计数细胞存活率。【试剂和器材】1试剂(1) Hanks液、待检