基因工程的载体和受体.ppt

1、一、用于基因克隆的载体,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。,1.载体的概念,1,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,2,2.载体的功能（function of vector）,运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,3.载体应具备的条件（characteristics of vec

2、tor）,可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或整合位点 。 具有较高的外源DNA的装载能力。 多克隆位点（multiple cloning site, MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点 。 具有合适的筛选标记（selection marker）。 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,3,质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体,第三章基因工程的载体和受体（5学时）

3、,4.载体的种类,4,（一）质粒（plasmid）,1.质粒的定义,质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。,质粒常见于原核细菌和真菌中。 绝大多数的质粒是DNA型的。 绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）。 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,5,（1）质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。,根

4、据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒：1 - 3 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒：10 - 60 拷贝 relaxed plasmid,但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其数量可达数千拷贝。,2.质粒的基本特征,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,6,（2）质粒的不相容性（incompatibility）,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒

5、组成不相容性群。,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容；,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容；,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,7,通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。,质粒不相容的分子机制,两种含有相似复制子结构的质粒，在复制

6、时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同。其中，拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。,两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时受各自的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,8,（3）质粒的可转移性,据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F质粒。,非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R质粒的一些成员。,值得注意的是，某些非

7、接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,9,（4）携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成：细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,10,3.几种代表性质粒,F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106 Dalton，94.5 kb，相当于核染色体

8、DNA大小的2%，环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiot

9、ic resistant genes.,11,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant）。RTF为分子量约为11106 Dalton，控制质粒拷贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。 R因子在细胞内的拷贝数：从12个到

10、几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,R因子（resistance factor）,12,Col因子（colicinogenic factor）,含有编码大肠杆菌素因子的质粒。 大肠杆菌素是由E. coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等专一地杀死其它肠道细菌，由Col因子编码。 Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1：分子量约为5106 Dalton，无接合作用，多拷贝； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制

11、系统上。 ColIb分子量约为80106 Dalton，与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个拷贝。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,13,只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可以编码一系列能降解复杂物质的酶，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,降解性质粒

12、,近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106 Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,巨大质粒（mega质粒）,14,Ti质粒（tumor inducing plasmid）,诱癌质粒 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。 当细菌侵入植物组织后，可以把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒大小约200 kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已

13、成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,15,4.质粒的改造,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工改造。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,16,删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段的装载量 灭活质粒上的某些编码基因 加入易于识别的选择标记基因 选择标记基因内引入内切酶的酶切位点序列

14、-多克隆接头(Polylinker) 加入特殊的基因表达调控元件,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,（1）质粒改造的策略,17,（2）一个合格质粒的组成要素,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,复制起始位点Ori：控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点 抗生素抗性基因：便于对目的基因的检测，如Ampr、Kanr 多克隆位点MCS：克隆携带外源基因的片段 P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子 T（Terminator）：终止信号 poly(A)加尾信号：稳定mRNA,18,5.质粒的分类,人工构建的质粒根据

15、其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,19,20,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,6.如何阅读质粒

16、图谱,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,21,RBS：ribosome-binding site 原核RBS：SD sequence 真核RBS：Kozak sequence,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,22,7.重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,（1）pBR322,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,23,（2）pUC18/19,拷贝数：2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ：E.coli lacZ基因的 5端序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳

17、糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,24,25,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,pUC18/19的正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 （IPTG）,X-gal,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,26,蓝白斑筛选 pUC18/19质粒上的LacZ基因包括一段-半乳糖苷酶的启动子、编码肽链的区段、一个多克隆位点(MCS)。 MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码肽链的功能活性。 当

18、菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用，使X-gal生成蓝色物质，这种现象即-互补。 用这种质粒进行克隆时，如果外源基因破坏了LacZ的编码序列，所产生的蛋白产物就会丧失-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑，可用于重组子的筛选。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,27,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,28,（LacZ基因序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,第三章基因工程的载体和受体（5

19、学时）,29,（3）pGEM-3Z,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子，用于外源基因的高效表达,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,30,8.质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高；但周期长，设备要求高，存在溴乙锭污染。,碱裂解法,质粒DNA纯度低；优点是快速、操作简便。,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴

20、之间,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,31,（1）氯化铯密度梯度离心法,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,ocDNA：开环DNA L-DNA：线状DNA,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,32,（2）碱裂解法,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白

21、质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,33,溶液I：调节pH，悬浮菌体，抑制DNase的活性 溶液II：裂解细胞膜（主要是NaOH），临用前配制，SDS是为沉淀染色体DNA作准备 溶液III：中和NaOH，促进SDS沉淀蛋白质和基因组DNA 详见,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,34,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,35,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,36,（3）沸水浴法,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶

22、菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,37,（二）噬菌体或病毒DNA,噬菌体（phage）或病毒（virus）是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得其DNA能被开发成为基因工程的载体，因为：,高效率的感染性能，使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能，使外源基因在受体细胞中高效扩增,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,38,1.大肠杆菌的噬菌体DNA,噬菌体是比细

23、菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,39,(1)噬菌体的生物学特性,l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因,生物结构,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,40,感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,41,100个左右的拷贝

24、,体内 包装,野生型l-DNA本身长度为48.5kb，包装范围为原DNA的75-105%，即36-51 kb。,溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为溶原状态。 整合主要由l-DNA上的cI和int两个基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,42,噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。 诱导的因

25、素可能很多，实验室常用的是热诱导: 某些噬菌体，在低温时（30）保持溶原状态，在高温（42）时进入溶菌状态。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。 clts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl ts1857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,43,（2）DNA载体的构建,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 因此需要缩短野生型l-DNA的长度，才能提高装载量。 其实

26、，野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解非必需的。在构建载体时，这些片段可以删除。 根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体和取代型载体。,缩短长度,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,44,插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小 0 - 14 kb,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,45,通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体（insertion vectors）。 由于 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入 6 kb 长的外源 DNA 片段，最大

27、14 kb 。,取代型载体：必须有外源基因片段的插入,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb （36-26） kb,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb （51-26） kb,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,46,插入位点,体外包装,删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除多余的酶切位点，每种限制酶只保留1 - 2个位点。 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添限制酶位点。,第三章基因工程的载体和

28、受体（5学时）,47,加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,48,Imm434标记,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。,lacZ标记,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶的片段，与b-半乳糖苷酶的片段互补，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色

29、化合物，形成白色噬菌斑；而空载体l-DNA则产生蓝色噬菌斑。,X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,是-半乳糖苷酶的显色底物,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，半乳糖的类似物，是乳糖操纵子的诱导物。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,49,构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 构建策略：将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白基因序列中的CAG密码子突变成UAG。 当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白

30、，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。 基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,50,（3）-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体： lgt10、lgt11,取代型载体：lEMBL4、Charon40,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,51,（4）DNA重组分子的体外包装,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。 这些包装蛋白通常分为互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D

31、组份。 包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行。任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染，均不能产生有感染力的噬菌体颗粒，这是基于安全考虑而设计的。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,52,（5）DNA及其重组分子的分离纯化,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期。 加入噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，37培养1小时。 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度可达1013 -1014/L，而大肠杆菌细胞已完全裂解。 超速离心，沉淀噬菌体 。 苯酚抽提，释放-DNA。 乙醇或异丙醇沉淀-DNA。,第三章基因工程的载体和受体（5学时

32、）,53,（6）-DNA作为载体的特点,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。 l-DNA载体的装载能力可达25 kb，远远大于质粒的装载量。 重组l-DNA分子的筛选较为方便。 重组l-DNA分子的提取较为简便。 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,54,2.大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,（1）M13噬菌体的生物学特性,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂

33、解宿主细胞，但抑制其生长,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,55,正链DNA,（2）M13 DNA载体的构建,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13 RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13 mp系列载体,lacZ,polylinker,复制DNA(replication form DNA，RF DNA),第三章基因工程的载体和受体（5学时）,56,（3）M13 DNA载体的特点,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外（因为M13噬菌体只包装正链），这在DNA定向突变中非常有用。,M13重组分子筛选简便

34、：被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。,但是，M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,57,动植物细胞作为受体细胞时，一般选择相应动植物的病毒基因组DNA作为载体。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体用于DNA重组实验。,3. 病毒DNA载体,第三章基因工程的载体和受体

35、（5学时）,58,（三）考斯质粒(cosmid) 与噬菌粒(phagemid),l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb。但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。 将噬菌体DNA上与包装有关的序列和质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。 注意：考斯质粒和噬菌粒不携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在

36、细胞内不能形成噬菌体颗粒。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,59,1.考斯质粒（cosmid）,（1）考斯质粒载体的构建,考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Ampr,PstI,BamHI,SalI,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为30 - 45 kb,pHC79,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,60,（2）考斯质粒载体的特点,能像l-DN

37、A那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,61,2.噬菌粒（phagemid or phasmid）,（1）噬菌粒载体的特点,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体的包装序列、复制子以及质粒的复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13 mp系列载体要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能

38、获得同等长度的单链DNA,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,62,（2）重要的噬菌粒载体,pUC118：pUC18 + M13间隔区 IG,pUC119：pUC19 + M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Ampr,M13-IG,pUC118 / 119,表示M13辅助噬菌体：为噬菌粒提供基因II产物和包装蛋白，使其能够合成单链DNA。,pUC118 / 119,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,63,pBluescript：体外转录载体,pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7,2958 bp,M

39、CS,lacZ,PT7,ori,Ampr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录。,提取出来的单链DNA重组分子，在噬菌体RNA聚合酶的存在下，可实现外源基因的体外转录。,f1-ori：线状噬菌体复制起始区,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,64,（四）人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，

40、便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,65,1.细菌人造染色体 Bacterial Artificial Chromosome，BAC,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的。 装载量：50 kb - 300 kb 拷贝数：各种类型的BAC在大肠杆菌受体菌中只能维持单一拷贝。,BAC主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster） 构建动植物基因文库（gene library）,第三章基因工程的载体和受体（5学时

41、）,66,2.酵母人造染色体 Yeast Artificial Chromosome (YAC),（1）酵母人造染色体的组成,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Ampr,TRP1,ARS1,两个来自嗜热四膜虫的末端重复序列(TEL)：保持重组YAC为线状结构,酵母染色体的着丝粒序列 (centromere4,CEN4),酵母选择标记：URA3、TRP1,大肠杆菌的复制子：ori,大肠杆菌的选择标记：Ampr,YAC载体的装载量为350 kb-400 kb,酵母染色体的复制子 (autonomously replicatingsequence，ARS

42、),第三章基因工程的载体和受体（5学时）,67,克隆位点：EcoRI。该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码产物抑制赭色表型 (成为白色)。如果用不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。,（2）酵母人造染色体的使用,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,在利用pYAC4载体克隆DNA片段时，要将pYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列

43、的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,68,Target DNA,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,69,二、用于基因转移的受体菌或细胞,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,70,作为基因工程的受体细胞，应利于外源DNA的转化或转导，同时又要有较好的安全性。 野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞，因其自身具有限制和修饰系统，对未经甲基化处理的外源DNA分子有一定的降解作用，导致外源DNA的转化或转导效率低下。 此外，野生型大肠杆菌对其他生物种群

44、可能存在潜在的致病性。 因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,71,（一）受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型：外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）,重组整合缺陷型：用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-， recB-，recC- ）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型：防止重组细菌扩散污染（生物武器除外）。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,72,限制与修饰系统 限制与修饰系统是维持野生型细菌种属特异性的保护系统，其限制与修饰作用分别由限制性核酸内切酶和修饰甲

45、基化酶来完成。当外源DNA分子进入细菌细胞内部时，限制系统产生限制作用，将来自不同生物的外源DNA分子或重组DNA分子降解破坏。而对于自身DNA分子则由修饰系统加以甲基化修饰，免于限制系统的限制作用。这是导致外源重组DNA转化或转导效率低下的主要原因之一。 应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源DNA分子的转化或转导效率。大肠杆菌的限制系统主要由hsdR基因控制，因此具有hsdR-遗传表型的大肠杆菌菌株均丧失了降解外源DNA的能力，大大增加了外源DNA的可转化性，转化效率可提高1000倍左右。 若进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源DNA分子，更便

46、于重组DNA分子的多种基因操作。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,73,重组系统 在野生型细菌中，进入细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生体内同源重组反应，该重组反应由rec基因家族的编码产物所控制。 其中RecA是一个单链蛋白，在同源重组过程中起着不可替代的作用，它能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换，recA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至10-6。 同样,recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因型为recA-、recB-或recC-等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。,第三章基因工程的载体和受体（5学时）,74,易于转化或转导 可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。如大肠杆菌膜蛋白Lama就是噬菌体的特异性吸附受体。 另外，