HPV分型检测的临床应用-基础版

1、HPV分型检测的临床应用,宫颈癌,全球聚焦,世界范围国际癌症研究所（IARC）统计 全球每年有50万宫颈癌新发病例，28.8万死亡病例 其中83%发生于非洲、拉丁美洲和亚洲等发展中国家 50的病例发生在亚洲 宫颈癌成为发展中国家妇女健康和生命的“头号杀手” 宫颈癌的发病趋于年轻化，发病年龄一般在40-60岁 2006年世界卫生组织指出：如不采取措施，未来10年内因子宫颈癌导致的死亡病例将上升25% 宫颈癌防治已成为全球关注的公共卫生问题！,宫颈癌,中国关注,宫颈癌预防已纳入国家医改、重大公共卫生项目和十一五国家重大支撑计划 2006年中央财政转移支付6个省6个亿的宫颈癌筛查 2009年，卫生部

2、启动两癌（宫颈癌和乳腺癌）筛查项目计划：2009-2011年在全国约200个县对1000万名妇女进行宫颈癌检查 新一轮“两癌”检查将在20122015年间实施，计划为5000万农村妇女提供免费宫颈癌检查，为600万农村妇女提供免费乳腺癌检查。 2012年已确定将为1000万农村妇女进行宫颈癌检查，为120万农村妇女进行乳腺癌检查。,宫颈癌与HPV,昨日回眸,1977年，Laverty 在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒 80年代，Harald zur Hausen 首先报告HPV与子宫颈癌间的相关性 随后，大量研究及流行病学资料显示 几乎100%子宫颈癌和95%以上宫颈高度病变中HP

3、V DNA检测阳性 1995年，国际癌症研究机构 (IARC)专题讨论会 HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件,宫颈癌与HPV,昨日回眸,2008年，Harald zur Hausen获诺贝尔生理学或医学奖 HPV与宫颈癌的关系的明确,宫颈癌成为目前癌症中： 唯一病因明确 唯一可以早期预防和治疗 唯一可以彻底根除的癌症,HPV,病毒学,HPV是一组病毒的总称 小环状双链DNA病毒，约8kb 颗粒直径为5055nm，无包膜 在自然界中稳定性好 在人和动物中分布广泛 有较高的种依赖性 具有嗜上皮性，在基底层细胞中潜伏 在鳞状上皮细胞中复制、转录和翻译、增殖,HPV,基因

4、结构,HPV16,晚期区（L区） 含两个结构蛋白 最保守的区域,长控制区（LCR）,E6 通过抑制p53而阻断凋亡 E7 通过抑制pRB使细胞周期失控,E4：结合并破坏中表层细胞角蛋白网，形成中表层细胞的挖空外观,L2:次要衣壳蛋白 抗体主要识别位点,L1: 主要衣壳蛋白， 疫苗研发的主要成分,HPV,病毒分类,以病毒基因组中L1区DNA同源性作为分类依据： 属：L1区DNA同源性在60%以下 种：L1区DNA同源性介于60%70% 型：L1区DNA同源性介于71%89% 亚型：L1区DNA同源性介于90%98% 变异株：L1区DNA同源性大于98%,HPV16型下分类,HPV16多态现象导致

5、的变异可根据地域不同，分为欧洲型（E）、非洲型（Af）、亚洲型（As）以及亚-美型（AA）。 不同变异可导致某些人群罹患宫颈疾病的风险增加。比如 AA具有较高的致癌性，主要体现在从原发感染至肿瘤形成仅需要不到3年的时间。,HPV,HPV,HPV分型,高危型 与宫颈癌及宫颈病变密切相关， WHO/IARC(2005):16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 疑似高危型： IARC（2009）:66、68、73 与宫颈癌有一定的相关性，但由于在人群中的分布频率较低或相关研究数据较少，需进一步研究确认 低危型 常引起外生殖道湿疣等良性病变，比如6、11、40、4

6、2、43、44、54、61、70、72、81、candHPV89等。 Schiffman M, Clifford G, Buonaguro F. Classification of weakly carcinogenic human papillomavirus types; addressing the limits of epidemiology at the borderline. Infectious Agents and Cancer. 2009; 4:1-8.,HPV,型别分布,2009-2012.5，全国35万数据（凯普21分型）,阳性率：24.6%（门诊）,HPV,型别分布,2

7、009-2012.5，华南区10万数据（凯普21分型）,阳性率：23.6%（门诊）,HPV,感染例数,总病,例数,宫颈,咽,肛门,口腔,喉,外阴,阴茎,每年病例数,0,100,000,2,00,000,3,00,000,4,00,000,5,00,000,HPV引发的癌症,HPV,HPV与宫颈癌,感染途径,性接触传播 丈夫阴茎HPV的存在可使妻子宫颈受染的危险增加9倍，相同的HPV型别可以在性伴侣中检出，与此相反，处女通常是检测不到HPV感染。 是性传播疾病但不一定有性乱史。 直接皮肤接触 这也是主要的传播途径 母婴传播 母亲生殖道HPV感染也可以传播至她们的婴儿口腔中,HPV与宫颈癌,HPV

8、的入侵,病毒通过皮肤或粘膜的微创口进入表层，然后感染基底层或副基底层细胞，并以附加体的形式在宿主细胞核内复制。 病毒的复制依赖于上皮细胞的分化，在基底层上层细胞中开始复制，在表皮细胞中装配，当这些表皮细胞脱落时，在皮肤表面可发现病毒颗粒。,HPV与宫颈癌,细胞、组织的改变,Transient infection,HPV infection,Persistent infection,Low-Grade Dysplasia CIN1,High-Grade Dysplasia CIN2/3,Invasive Cancer,1 year,Over 2 years,2-5 years,4-5 years

9、,9-10 years,HPV与宫颈癌,影响因子,树木的成长（宫颈癌的发生）=种子(高危HPV)+土壤(未成熟的宫颈转化区化生上皮)+cofactors 多个性伴侣 口服避孕药 HIV、STI感染 免疫缺陷 多产、密产 吸烟等,宫颈癌的筛查,筛查现状,宫颈癌的筛查,筛查对象,所有女性应在有性生活3年开始做宫颈癌筛查 （最晚不超过21岁） 2009.1 NCCN子宫颈癌筛查临床实践指南 2003卫生部宫颈癌筛查及早诊早治指南 高危妇女人群：多个性伴侣、性生活过早、HIV/HPV感染、免疫功能低下、卫生条件差/性保健知识缺乏的妇女 决定妊娠的妇女,案例分享,女，28岁，孕前体检，医生建议其进行宫颈

10、癌的筛查，拒绝。后怀孕5个月出现流血症状，疑为先兆流产，进行保胎处理；保胎至7个月大出血，后组织病理切片确诊为宫颈癌。产后手术治疗不理想，于宝宝一周岁多死亡。 广东省妇幼保健院 著名影星李媛媛，2002年因宫颈癌在北京病逝，撇下了她一岁的儿子和心爱的观众。,宫颈癌的筛查,技术的发展,1943年巴氏涂片应用于宫颈癌的筛查,1988年TCT应用于宫颈癌的筛查,2003年高危HPV(HC2)应用于宫颈癌的筛查(辅助),2004年中国指南HPV+TCT为最佳宫颈癌筛查手段,2007年欧洲EUROGIN 推荐HPV作为宫颈癌筛查首选手段,2011年HPV分型检测是国际公认最重要的宫颈癌筛查手段,2005

11、年IARC/WHO推荐HPV检测可以用于宫颈癌筛查,2006年HPV分型检测（凯普）应用于宫颈癌筛查,宫颈癌的筛查,巴氏涂片及TCT的应用,对妇女健康作出很大贡献 局限性: 取样误差 / 制片误差 / 读片误差 敏感性差、假阴性率高（2%50%）、假阳性率高、漏诊多 可重复性差，受阅片人主观影响,宫颈癌的筛查,准确性97% 敏感度低，尤其是腺体病变 重复性差，没有改变传统的阅片方式，与人为主观因素相关 无法预测患病的风险性,巴氏涂片及TCT的应用,宫颈癌的筛查,HPV DNA检测,宫颈癌的筛查,有充足的证据表明： HPV DNA检测可作为子宫颈癌的初筛手段，并可以降低子宫颈癌的发病率和死亡率。

12、 -IARC/WHO，2005,HPV检测为首选,大规模筛查手段,任何筛查项目的初筛都应该采用更为敏感的检测实验。 单纯HPV检测的敏感性大大优于宫颈细胞学。 过分强调特异性，会使筛查工作堕入美国式的怪圈：检查越来越多，查出得越来越少，成本却越来越高 。,Belinson-国际防癌组织主席,“我本人已被众多文献完全说服，承认今天的子宫颈癌筛查当始于HPV检测。” -Belinson,2011.6.5中国HPV数据库启动会,宫颈癌的筛查,宫颈癌的筛查,首选HPV检测,欧洲生殖道感染和肿瘤组织（EUROGIN)2007年提出的宫颈癌筛查方案,宫颈癌的筛查,HPV分型的应用,专家意见,2012AOG

13、IN会议调查结果： 问题：对细胞学检查阴性的患者进行基因分型有意义么？ 1.错误-基因分型并不能带来益处 14% 2.正确-基因分型可以带来益处 86%,Sun-Kuie Tay,2012亚太生殖道感染与肿瘤会议（AOGIN 2012）,HPV分型检测,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于区分一过性感染或持续性感染,在对丹麦2029岁妇女进行HPV检测时发现：间隔18个月2次检测HPV，相同基因型的HSIL发病风险明显高于不同基因型。（Susanne K Kjaer,et al. BMJ. 2001: 325: 7364.） HPV持续性感染：如果在间隔4-6 个月或 6-12个月的相

14、邻2次随访中，同一患者的阴道宫颈检测样本均显示HPV 阳性且为同种类型，则称为此种类型 HPV 的持续性感染.Koshiol et al. Persistent Human Papillomavirus Infection and Cervical Neoplasia: A Systematic Review and Meta-Analysis。Am J Epidemiol 2008;168:123137 提示：只有高危型的HPV持续感染才会发展成为宫颈癌,47岁，2010年8月病患到宫颈门诊检查，当时的她已行子宫次全切除手术后两年，做HPV分型检测，结果为HPV58型阳性，细胞学检测为阴道炎

15、症，阴道镜检测为CIN-。对该病患进行随访观察，一年后，病患做HPV分型检测，结果仍为HPV58型阳性，细胞学检测为阴道炎症，考虑到该病患为HPV高危阳性的持续感染，决定对其行Leep诊断性锥切及组织性活检，结果发现该病患为宫颈原位癌(CINIII)。,上海市松江妇幼保健院,案例分享,李女士，25岁，2008年2月到广东省妇幼就诊，发现HPV16（+），TCT：良性反应改变。宫颈重度糜烂。阴道镜：CIN，病理CIN，并进行了宫颈锥切术。2008年9月随访，持续HPV16（+），TCT：HSIL，阴道镜：CIN，病例，CIN累腺。2008年11月随访，HPV16（+），由于怀孕拒绝宫颈活检。20

16、10年6月，产后9个月，宫颈活检：子宫颈鳞状细胞癌。 广东省妇幼保健院宫颈病变中心毛玲芝教授,案例分享,女性，25岁，2008年2月27日，HPV16（+），TCT：良性反应改变。宫颈重度糜烂。阴道镜：CINI，病理CINII，行了宫颈锥切术。2008年9月HPV16（+），TCT：HSIL，阴道镜CIN2，病理：CINII，累腺。2008年11月HPV16（+），拒绝宫颈活检。2010年6月28日，产后9个月，宫颈活检：子宫颈鳞状细胞癌。广泛全子宫切除加盆腔淋巴结清扫，病理：子宫颈鳞状细胞癌（中分化型），位于宫颈上唇（12-1点），溃疡型,癌组织浸润宫颈间质浅层,溃疡处浸润深度约5mm，宽约

17、1cm。此例是HPV16持续阳性两年最后导致宫颈癌。 广东省妇幼保健院,案例分享,早期的文献报道，HPV的多重感染与宫颈癌直接相关。 现在越来越多的报道发现，HPV的多重感染与宫颈癌之间，不存在显著性的关系。,潮州宫颈癌筛查工程-广东省妇幼保健院 毛玲芝,在CIN2以上高级别病变中，多重感染并不常见，以单一感染为主。,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于区分单一感染或多重感染,女，41岁，2010年做妇科检查，HPV为多重感染，TCT(-)，医生建议半年后复查。2011年3月患者进行复查，TCT(-)，HPV感染型别比原来少了两个，病人因为少了两个型别很高兴，但妇科主任很重视，建议其进

18、行活检，阴道镜下宫颈表面光滑，无任何异样，主任还建议进行多点随机组织取样，检查结果为原位癌，病人随后被送到省肿瘤医院，妇科主任亲自手术，现已痊愈、恢复出院。 分析： 1、HPV持续感染是引发宫颈癌的生物学诱因 2、病人两次都检测出HPV阳性，但液基细胞检测两次均为阴性，说明HPV检测比细胞学检查具有更高更明显的敏感度。 湖南省湘潭市妇幼保健院,案例分享,不同型别的致癌风险不同,不同的高危型促进LSIL向SCC转变的能力有差异。 HPV16，18 的致宫颈癌风险性大于其他高危型HPV。,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于阴道镜适应征,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于阴道镜适

19、应征,2009/2012年，美国ASCCP发布了HPV 基因分型检测指南，明确指出: 30妇女，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，HPV16，18建议阴道镜;其他HPV高危型，则在12个月后重复HPV DNA检测和细胞学检查。（American Society for Colposcopy and Cervical Pathology, 2009） 2010年，杨英捷、赵健、毕蕙等人的研究数据表明，HPV31、33的致癌风险也很高，建议HPV31、33直接行阴道镜检测,44岁女性，2008年10月24日，妇检宫颈光滑，滴虫（+）HPV16，52（+），TCT：炎细胞中度。未行阴道镜检查，2010

20、年10月18日。阴道镜下宫颈活检病理:鳞状细胞癌（中分化）。未按规范筛查及随访，导致宫颈癌发生。 广东省妇幼保健院 37岁，细胞学检测结果为非典型腺细胞（AGC）并伴有阴道炎症，HPV分型检测为HPV16型阳性；医生建议病人做阴道镜及组织活检，不过，当时病人没有同意。该病患回去后，考虑再三，两个月后才来到医院宫颈门诊做阴道镜检查。对该病患做Leep诊断性锥切及组织性活检发现，该病患为宫颈原位癌(CINIII)。 上海市松江妇幼保健院,案例分享,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于ASCUS分层管理,NCCN 子宫颈癌筛查临床实践指南 (2012)指出：对发生在成年人的ASC-US&LS

21、IL有3个可供选择的方案，可选择HPV-DNA检测将患者分流、6个月复查细胞学或立即阴道镜检查。 阴道镜即使按照规范流程执行，依然有30%的漏诊HSIL。 直接阴道镜检查或多点病理活检，引起创伤和过度诊治（40-60%） 重复细胞学检查，有25%失访率，此外复检会增加病人经济及精神负担 HPV检测：为目前的最优方法。HPV检测阴性，可列入常规筛查人群；如HPV检测阳性，则考虑配合阴道镜检查,41岁女性，2010年10月，主诉性交出血，妇检；宫颈光滑。HPV16（+），LCT ASCUS，阴道镜：宫颈2点0.5mm溃疡，未见醋白及异型血管。因患者一直有性交出血，一个月后病理：宫颈鳞状细胞癌。 分

22、析： 此例LCT及阴道镜均漏诊了宫颈癌。 广东省妇幼保健院,案例分享,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于宫颈癌晚期治疗手段的选择,HPV18,Advanced cervical cancerAdding chemo to RT:HPV18,58: improving survivalHPV16,33: minimal benefit,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于宫颈病变的随访,宫颈病变治疗后失败的主要原因是同一基因型HPV的持续性感染,据瑞典的一项研究，针对完成宫颈锥切术后，术后随访结果有26例CIN复发；22例未复发。术后3个月用PCR方法检测宫颈细胞涂片HPV，其

23、中： 26例复发者：25例为HPV阳性 22例对照组：全部为HPV阴性 实验说明：宫颈病变治疗后检测HPV-DNA，可预测残余病变、估计疗效。,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于宫颈病变的随访,女；年龄54岁。于2011年3月14日到广东省妇幼保健院妇科就诊，临床诊断为“子宫颈炎”，行HPV分型检查其结果为HPV高危型16阳性。病人经手术治疗后，于同年的7月19日再次到省妇幼妇科就诊（看诊的不是同一医生），临床诊断为“子宫颈恶性肿瘤术后”，又复查HPV分型项目，其结果则为高危型68阳性，此标本再做HPV13荧光检查其结果也是阳性，CT值是28.9。 针对此问题进行分析，得出以下几点原

24、因： 1）此病人重新感染了HPV病毒； 2) 第一次检查中HPV的两种型别产生了竞争性的抑制，术后优势性别HPV16型被去除，HPV68型显现； 3）两次检查医生取样的部位不一致。 广东省妇幼保健院,案例分享,43岁女性，于2009年4月到广东省妇幼保健院妇检，HPV分型检查结果为HPV16（+），遂行阴道镜检查，拟诊为HSIL，即进行leep术，术后病理检查为CIN2；于2010年9月进行复诊，HPV分型检查结果为HPV56（+），细胞学检查结果为低度鳞状上皮内瘤样病变，阴道镜检查拟诊为LSIL，病理检查为CIN1，该病情有所减轻。 31岁女性，每年1次定期体检，于2011年5月体检时，HP

25、V分型检查结果为HPV16、33阳性，细胞学检查为ASC-US，行阴道镜检查，拟诊为HSIL，病理检查为CIN3，即进行锥切；于2011年10月进行复诊，HPV分型检查结果为HPV33阳性，细胞学检查为低度鳞状上皮内瘤样病变，阴道镜检查拟诊为LSIL，病理检查为CIN1，病情减轻，继续观察。 广东省妇幼保健院,案例分享,HPV分型检测,临床应用,HPV分型检测用于指导疫苗的开发,针对衣壳蛋白（L1）的IgG和IgA中和抗体在病毒感染的早期较为重要-预防性疫苗 默沙东：Gardasil（6、11、16、18） 葛兰素史克： Cervarix（16、18） 针对早期基因（E6/E7）的细胞免疫反应

26、对最终清除病毒可能更为重要-治疗性疫苗,宫颈癌的预防,预防手段,定期进行HPV检测,51,CE、SFDA认证,中国宫颈癌防治工程唯一指定的HPV分型检测产品 中国女性HPV数据库的主要承担者,凯普HPV21分型,52,检测原理,凯普HPV21分型,PCR，Polymerase Chain Reaction（聚合酶链式反应） 导流杂交技术（凯普自主创新技术） 高效、快速、灵敏、准确,导流杂交VS传统杂交,导流杂交VS传统杂交,55,实验过程,凯普HPV21分型,结果判读与分析,凯普HPV21分型,对于阴性样本，只有生物素点和IC点同时显色才是正常结果。 对于阳性样本，如果生物素点、IC点和阳性点

27、都显色，则结果正常； 有些阳性样本，生物素点和阳性点显色，但IC点不显色，结果也是正常。,结果判读与分析,凯普HPV21分型,58,产品优势,凯普HPV21分型,论文,科研项目,HPV数据库,卫生部临检中心HPV检测行业室间评估,WHO HPV网络监测评估,国内外核心期刊上 发表文章超过150 篇，其中SCI收录 国际论文15篇。,参与国家863（北京大学 附属第一人民医院）和 973项目（华中科技大学 附属同济医院）以及省市 各级地方项目研究20余项。,同卫生部合作，凯普公司 主导，北大附属第一人民 医院、武汉同济医院、复 旦大学附属妇产科医院及 广东省妇幼联合参与。,中国临检中心之前一般只

28、对HPV16和18 两种型别进行测试。随着凯普21基因分 型的推广，促使了中国临检中心从2012 年5月开始对临床机构进行包含HPV16 和18之内的多个HPV型别的检测评估。,学术影响力,凯普HPV21分型,2010,2011连续两年参与WHO HPV网 络试验评估，国际上使用凯普21基 因分型检测产品的实验室（伊朗、 马来西亚、中国香港、中国上海， 中国潮州）检测结果同WHO提供的标 准品检测，对16、18检测灵敏度高。,宫颈癌的筛查,学术影响,2011年6月5日，第二届中国凯普HPV学术研讨会,凯普HPV21分型,国际HPV协会会长，著名HPV研究专家Tom Broker说： 凯普的HP

29、V基因分型检测产品在宫颈癌筛查方面是一个里程碑。这句话总结出了凯普HPV产品在国际社会上的学术影响力。,凯普HPV21分型,国际评价,62,市场份额,凯普HPV21分型,HPV分型检测 中国市场占有量第一,HPV分型试剂盒作为国内唯一远销海外的分型产品，已成功打入到西班牙、日本、土耳其、以色列、印度、尼日利亚、新加坡、马来西亚等17个国家。 已有1200多家检测机构在使用凯普HPV分型产品。 检测网点遍布全国各省，临床检测量已达到550万人份。,“HPV分型，世界看中国，中国看凯普”,月经期不可采集标本。（减少给受检者的损伤） 月经正常妇女，在月经来潮后1018天为最佳检查时间 不可在碘试验和

30、醋酸试验之后采集样本。（可能会抑制PCR反应） 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。（可能会抑制PCR反应） 检查前48小时最好不要行性生活。（一过性假阳性） 样本采集后，注意避免交叉污染。,注意事项（1）,样本的采集,采集部位,样本的采集,HPV-DNA检测样本是子宫颈转化带的脱落细胞。 妊娠取样：与非妊娠期相比,妊娠期由于高水平性激素的作用,使宫颈鳞柱状细胞交界线外移,柱状上皮暴露于宫颈阴道部,易于取材,并不增加检查的难度。 妊娠进行取样是安全的（NCCN.2012）,凯普宫颈细胞采集器及细胞保存系统对于采集足够的宫颈脱落细胞和长期保存细胞样本十分必要。 为了保证

31、所采集细胞样本的质量，要求在采集细胞前先用棉拭子拭去宫颈口的分泌物。,凯普一次性宫颈细胞采集器,采集工具,样本的采集,取样管上标签的名称须与患者一一对应。 使用凯普专用取样器及保存液，可抑制细菌生长，保持DNA完整性。 宫颈保存系统包装打开后，必须立即进行采样，并连同刷头置于取样管中。 样本收集中为保留足够的宫颈细胞标本，注意切勿将宫颈刷头丢弃。 宫颈刷头折断、试验取样时，请小心操作，切忌大力震荡取样管，造成试剂及样本溅出影响检测结果或造成污染。 取样后，切记拧紧取样管管盖。,样本的采集,注意事项（2）,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。 如若不能马上送检样本，请于4保存，并在2个星

32、期之内进行检测。 长期保存请放于-20。,注意事项,样本的保存,凯普公司成立12年，致力基因分子诊断研究，并且在人乳头瘤病毒（HPV）检测研究方面取得世界领先地位。基于公司自主知识产权的导流杂交技术平台（美国专利号：5741647； 6020187）和通用荧光PCR技术平台，开发出了一系列针对宫颈癌早期筛查的HPV检测产品。,公司系列HPV检测技术产品，可以针对临床检测和大规模人群筛查等不同的需求，采用单一产品或者不同的HPV产品组合，在保证灵敏度和特异性的前提下，以最合适的性价比向医院、科研或政府部门提供优质的服务，造福于广大妇女。,凯普公司介绍,公司定位,凯普公司介绍,产品及服务,HPV 核酸分子测序,21种人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒 37种人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒,13种高危型人乳头状瘤病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒 14种高危型人乳头状瘤病毒联合16/18基因分型检测（12+2）