生物试验安全防护.ppt

1、生物實驗室安全防護須知,銘傳大學 生物科技學系 張猷忠,生物實驗室安全防護目的,保障人身安全 保障操作者本身的安全 維護實驗室其他成員的安全 保障實驗室外其他第三者的安全 避免環境污染 避免造成實驗室內環境的污染 含儀器，如冰箱、離心機、微量分注器等 實驗桌、門把及實驗室地面等 避免造成實驗室外環境的污染 如動物飼養場、河川、魚、土壤、植物或作物等,生物實驗室的危險來源,所操作的生物及微生物 如病毒、細菌、真菌、寄生蟲和實驗動植物等。 藥品和試劑 如酸、鹼、致癌物、放射性同位素、毒性物質、易燃物質和危險氣體等。 儀器設備 如高壓蒸氣滅菌鍋、離心機、紫外光觀察箱、高熱烘箱和電泳設備等。 管理制度

2、和人 如生物感染性廢棄物的處理、儀器使用教學及維護、人員健康管理及監測等。 在人方面，包括壓力調適、健康照護、情感處理、學術競爭、個人的責任義務和道德感等。,實驗室病毒感染實例,台灣(2003/12)、新加坡(2003/9)及中國(2004/7)都曾發生實驗室人員感染SARS事件： 預防醫學研究所詹姓研究員是在卸下全身所有的隔離防護裝備後，才操作病毒器皿滅菌步驟，因突發狀況，且無安全防護裝備而感染。 2005/3/26：流感病毒(H2N2)的實驗室感染。 2005年2月美國病理學家協會發送含H2N2流感病毒的樣本。 1968年以後出生的人，對H2N2病毒並不具有，或僅具有有限的免疫力，H2N2

3、病毒也不包含在目前的三價流感疫苗中。 培養分離新城病病毒(Newcastle disease virus)，造成大學教師及研究生感染結膜炎。 1956年，前蘇聯某實驗室，9支裝有感染了委內瑞拉馬腦炎病毒鼠腦的安瓶被打破，幾天內就造成24名工作人員感染。,實驗室病毒感染實例,1979年，英國Birmingham大學的一起實驗室意外，造成天花病毒散播： 兩個人感染，其中一人死亡。 實驗室負責人也因此自殺。 1961年，莫斯科實驗人員從流行性出血熱疫區捕捉到一些野鼠帶回實驗室。由於疏忽，這些野鼠被放在了室內暴露的場所。不久，實驗室有63人相繼出現發熱症狀，開始被誤診為流感，1周內又增加了30人，才開

4、始懷疑到是流行性出血熱。 1998年，中國西安某高校在使用大白鼠進行試驗時，有兩名學生被大白鼠咬傷，還有一些學生給實驗老鼠放血、解剖。在實驗過程中，這些學生均未按照要求戴手套操作： 結果在29名實驗人員中，有 9人感染了流行性出血熱。 該病原會經由氣霧(Aerosol)傳染。,實驗室細菌和原蟲感染實例,北部某公立大學研究生感染研究中的題材，流產布氏桿菌(Brucella abortus)。 美國NIH曾發生Q fever (Coxiella burnetii)實驗室感染，導致153人發病，其中1人死亡。 2006/9/17：中部某大學發生實驗室博士班學生感染桿菌性痢疾(Shigella fle

5、xneri )事件。 2004年，該校另一間實驗室也曾發生登革熱感染意外。 後果：實驗室被關閉。 其他細菌之實驗室感染實例： 肉毒桿菌(Clostridium botulinum type A )、沙氏桿菌(Salmonella spp.)等。 1986年的一次實驗操作意外，造成南部某學校實驗室助理感染弓蟲。 幾乎與隱胞子蟲(Cryptosporidium parvum)實驗有關工作者都會受到感染，尤其是以小牛下痢為卵囊來源時。 證據顯示卵囊可能經由空氣傳染。,病原外洩的安全隱憂,操作或保存中的微生物外洩： 引發人類疾病 天花病毒(Small pox virus)、炭疽桿菌(Bacillus

6、anthrax)、肺結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)等。 前蘇聯斯維爾德洛夫斯克實驗室的洩露事故：1979年4月的一天，某陶瓷廠的一些工人來到醫院。他們的病狀是發燒、咳嗽、胸痛。第一批到醫院的病人病情迅速惡化。幾個小時以後，數人死亡。事後人們才得知，當地的生物武器實驗室曾發生了一次爆炸，約10公斤的炭疽芽孢粉劑洩露，爆炸釋放出大量的細菌毒霧，造成附近1000多人發病，數百人死亡。 美國州立大學布氏桿菌病實驗室的一起布氏桿菌洩露事件，共感染了45人，死亡1人。 造成動物傳染病 最近案例：口蹄疫病毒(FMD virus)由英國實驗室外洩。,病原外洩的安全隱憂,與外界

7、病毒產生核酸重組 流感病毒(Influenza virus)、輪狀病毒(Rotavirus)、Norovirus等。 與外界細菌交換遺傳物質 抗藥性或毒素基因的散佈及交換。 實驗動物攜帶病原： 美聯社報導(2005/9/16)：大約在兩週前，三隻感染了黑死病細菌(Yersinia pestis)的老鼠，從一個實驗室裏不見了。 1967年，歐洲的三個城市為研製疫苗，從烏干達等地進口了一批黑長尾猴，而這些猴子攜帶一種特殊的病毒，引起了13名工作人員患病，並使這種疾病在德國馬堡等地區流行，馬堡病毒(Marberg virus)由此而得名。 被感染人員散播病原 台灣預研所SARS事件，當事人發燒後6天

8、，始自行至診所、醫院看病，並曾到新加坡開會。 後果：有70位新加坡人須被隔離，有20多名國人需作自我健康管理，被感染者差點沒命。,操作核酸外洩的安全隱憂,實驗室操作的核酸外洩： 抗除草劑基因、抗殺蟲劑基因。 仍在實驗中的轉基因作物或動物。 重組病原核酸。 毒素和抗藥性基因。,生物實驗之安全法規,國科會頒有基因重組實驗室守則 同時考慮重組體及生物性安全防護 國內持有、保存或使用第二級以上感染性生物材料單位，為落實實驗室生物安全自主管理，避免發生實驗室感染意外，應依法成立生物實驗安全委員會或指派專責人員， 確實督導實驗室各項生物安全相關事項之執行，並依相關核備程序向主管機關申報 否則依傳染病防治法

9、第63條規定，可處以新台幣9萬元至45萬元之罰鍰。,生物實驗審查程序,生物實驗安全委員會 第二級及以上危險群微生物之實驗，必需經由研究機構生物實驗安全委員會批准。 需經由行政院所屬主管機構核准後方可進行之實驗 選殖產生劇毒之基因 將抗藥性基因殖入病原微生物 人體試驗委員會(IRB, Institutional Review Board) 有關醫學實驗相關的人體試驗及檢體採樣，須先經IRB審核批准。,基因重組實驗的防護,物理性防護層級(Physical Containment Level) 物理性防護的目的是將重組體隔離在設施或設備內，防止實驗人員和其他物品受到污染，並且防止其向外界擴散。 因封

10、閉程度的不同，區分為P1、P2、P3和P4四等級。 生物性防護層級(BSL：Biosafety Level) 須同時考慮重組DNA載體及宿主系統之安全性；降低在實驗室外環境中，載體在其宿主中的存活力，實驗用宿主中的載體轉移到非實驗使用的宿主。 分為BSL-1、BSL-2、BSL-3及BSL-4四等級或ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3及ABSL-4四等級。,生物實驗室分級,P1 lab (BSL-1): 可處理第一級危險群微生物之實驗室。 通常這一類微生物與人類健康或成人之疾病無關。 P2 lab (BSL-2): 可處理第二級危險群微生物之實驗室。 在人類所引起的疾病很少是嚴重的，一般

11、來說，傳染力有限，而且通常有預防及治療的方法。 P3 lab (BSL-3): 可處理第三級危險群微生物之實驗室。 在人類可以引起嚴重或致死的疾病，可能有預防及治療之方法。 P4 lab (BSL-4): 可處理第四級危險群微生物之實驗室。 在人類可以引起嚴重或致死的疾病，目前並無預防及治療之方法。,瞭解實驗室的生物性材料,要知道系上實驗室有使用到那些生物性材料。 種類、來源、致病性、防護方法等。 目前系上所保存的第二級危險群微生物(RG2) Fungi Aspergillus fumigatus Viruses Newcastle disease virus, Human rotavirus

12、es, Noroviruses, Astroviruses, Human adenoviruses Bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Salmonella derby, Salmonella panama, Salmonella dublin, Vibrio parahaemolyticus,瞭解病原可能的感染途徑,空氣或氣霧傳播 S

13、ARS, Flu, TB 空調、不當的實驗或儀器操作、帶病工作。 有無穿帶適當的防護設備，如口罩、實驗衣等。 有無在合適的生物安全操作箱操作。 不慎吸入 黴菌孢子、真菌、細菌或病毒培養液。 食物或飲水 Salmonella spp, pathogenic E. coli 使用實驗用微波爐烹煮食物、食物放置實驗室冰箱。 皮膚或黏膜接觸 NDV, parasites 污染桌面或門把、不良衛生習慣、實驗意外。 器械感染 如針頭和刀片。,生物安全等級第一級- BSL1 or P1 Lab -,包含標準實驗室操作 適合對操作人員及環境無或低危害的物質RG1及一般標準重組DNA的試驗環境 實驗室設施：(第

14、二道防護) 要有門與外界隔開，窗戶要裝設紗窗或屏障 在建築物中，實驗室無需與主通道加以區隔 工作通常在開放空間的操作台上進行 工作桌面要易於清潔及不透水 不需要特別的隔離設備，亦不常使用 安全防護設施：(第一道防護) 保護衣物：實驗衣、手套 人員保護裝備：面罩、眼鏡或眼罩 人員訓練要求： 監督管理者：具有微生物或相關學科的一般訓練 實驗室人員：具有實驗室操作流程的特定訓練,P1級實驗室-實驗實施要項-基因重組實驗室守則規定-,進行實驗時，宜關閉實驗室的門窗。 每日實驗結束時需滅菌實驗台，如實驗中發生污染，需立即加以滅菌。 實驗所產生之所有生物材料廢棄物，在丟棄之前需滅菌。被污染的器具需先經滅菌

15、後，再清洗使用或丟棄。 不得用口做吸量操作。 實驗室內禁止飲食、吸煙及保存食物。 操作重組體之後，或離開實驗室之前要洗手。 在所有操作中，應儘量避免產生氣霧。 要從實驗室搬離被污染物品時，必需將其放入堅固且不漏的容器，在實驗室內密封後才可運出。 防除實驗室的非實驗用生物，如昆蟲及鼠類等。 若有其他方法可用，應避免使用針頭。 實驗用衣物的使用，需遵從計畫主持人的指示。 需遵守計畫主持人所訂之其他事項。,滅菌及消毒,高壓蒸氣滅菌(Autoclave) 滅菌方法：高壓蒸汽滅菌121，15 p.s.i.，1540 min 適合所有污染物之殺菌 滅菌指示帶、滅菌專用塑膠袋、滅菌用不銹鋼桶或盤 紫外光滅菌

16、 無菌室或BSC使用前後，或污染區域照射 至少30 min 70% Ethanol or 50% Isopropanol 皮膚或桌面和地面的污染 次氯酸鈉(Hypochloride, 高力士漂白水) 120%稀釋液 桌面和地面污染；器械、塑膠和玻璃器皿之殺菌處理 中性肥皂或洗手乳 洗手用,實驗室物品的清洗,一般玻璃器皿先以清潔劑（沙拉脫）浸泡刷洗，自來水洗淨，二次去離子水沖洗後，陰乾或烘乾備用 有培養或污染病原微生物、或其他重組DNA實驗使用的微生物時，應先將器皿滅菌後，再清洗 有沾染蛋白質的器皿，應在使用後清洗前，浸泡於含清潔劑的水中 有沾染微生物或病毒的器皿，在使用後清洗前，應浸泡於含次氯

17、酸鈉（漂白水）的水中,可能產生氣霧的原因,把燒熱的接種用白金環或接種針插入培養基，或燒熱的金屬板接觸生物性材料。 以加熱法滅菌含生物性材料的接種環。 以煮沸或微波來加熱生物性材料。 用力排出吸管或針筒內之液體。 快速吸排微量分注器。 搖晃含生物性材料的液體，讓液面產生泡沫。 以離心機、均質機、超音波破膜儀、或真空乾燥機處理生物性樣本。 使用Vacuum pump時。 以Shaker或Roller培養生物性材料(旋轉速度過快時)。,微量分注器,Aspirator bottles or suction flasks,生物安全等級第二級 - BSL2 or P2 Lab -,適合對人員及環境會造成中

18、度危險物質的操作 實驗室設施：(第二道防護) 生物安全等級第一級實驗室設施，加上高溫高壓滅菌箱及沖洗眼睛設備 實驗室要與公共區域分離，要有可以上鎖的門 空氣流入實驗室不可再循環到其他非實驗室區域 具有Class I或II生物安全操作櫃 安全防護設施：(第一道防護) 依照生物安全等級第一級安全防護設施 人員訓練要求： 監督管理者：具有能力勝任相關責任 實驗室人員：具有對病原的相關知識 要有實驗室專用生物安全手冊 視需要實施免疫措施及人員血清採集 其不同點在於： 工作進行中，不可進入工作場所。 某些會造成感染性氣霧的操作，須在生物安全箱(Class I或II)或其他隔離設施中進行。,實驗室沖洗裝置

19、,全身淋浴沖洗裝置 洗眼器 沖洗裝置的日常保養 勿把玩沖洗裝置,洗眼器,洗眼器,沖洗器,P2級防護實驗室-硬體要求-,實驗室除了具備跟一般微生物學實驗室相同等級的設備外，需設置生物安全操作箱(第一級或第二級)，且要做定期檢查。 為了處理第二級危險群微生物，而使用容易產生氣霧的磨碎機、冷凍乾燥器、超音波細胞打碎機及離心機等儀器時，需把這些儀器放置在安全操作裝置中(第一級)。但若機器已經有防止氣霧外洩的裝置，則不在此限。 實驗室需具備處理污染物及廢棄物滅菌用之高壓滅菌器，最好放置於同一房間，如有困難，則可置放於鄰近處。 實驗室宜置有UV燈及雙重門，如無雙重門，則門必須為密閉式 實驗室宜設有可用腳或

20、肘操作或自動的洗手的裝置。 若在此級實驗室內同時進行P1級的實驗時，需明確劃分實驗區域，小心進行操作。非基因重組的實驗，亦需明確劃分實驗區域。 進行實驗時，須關閉實驗室的門窗。,層流清淨工作台-Laminar Flow Clean Bench“-,HEPA Filter,HEPA (High Efficiency Particulate Air) filter filters particles to 0.3 microns at 99.97% efficiency. Where particulates such as toxic powders and fibers are of conc

21、ern, a HEPA filter may be installed.,第一級生物安全操作箱-Class I Biological Safety Cabinet-,The Class I BSC provides personnel and environmental protection, but no product protection.,Chemical Fume Hood,第二級A1型生物安全操作箱-The Class II, Type A1 BSC-,30%,70%,通常可分為一般生物性作業時使用之A型，及操作含有少量有害危險化學物質、放射性物質、氣體、致癌物質等HEPA過濾器無

22、法有效捕集去除之物質之作業時使用之B型,下吹氣流 0.5 m/sec,第二級A1型生物安全操作箱,第二級B1型生物安全操作箱-The Class II, Type B1 BSC-,70%,30%,30%,70%,下吹氣流 0.5 m/sec,第二級B2及B3型生物安全操作箱-The Class II, B2 & B3 BSC-,Type B2,Type B3 (A2),100%,30%,70%,下吹氣流 0.5 m/sec,排氣管路與氣室、循環管道需設計為負壓,第三級生物安全操作箱-The Class III BSC-,負壓值通常約為0.124 kPa,P4 lab必備,防氣霧外洩的裝置,O-

23、ring,上蓋,生物安全等級第二級-標準微生物操作程序-,依照生物安全等級第一級的標準微生物操作程序規定。 實驗室入口必需貼有生物危害警告標誌，要有進出的規定及流程。 操作第二級危險群微生物時，需戴手套以防污染，操作完畢後及離開實驗室前，需洗手或消毒。 當處理高濃度、大體積、易潑濺或產生氣霧的感染病原時，必需在Class II生物安全操作櫃內進行。 針及尖銳物的預防措施： 使用過的針頭應單獨放置於堅固容器內，不可丟棄在一般廢棄物容器內，或是以針頭銷毀器銷毀。 不要用手接觸破碎的玻璃。 若有液體濺灑或發生意外，應報告。,污染或可能感染的處理,立即報告老師。 污染面除污、洗淨和消毒。 脫下污染衣物

24、，浸泡於10100X次氯酸鈉漂白水中至少30分鐘，再以洗衣機洗淨並烘乾。 必要時，就醫觀察，並告知污染病原種類，或投予預防性抗生素。 必要時，通知疾病管制局或動植物防疫檢疫局。,P2級防護實驗室 -基因重組實驗室守則規定-,不得用口做吸量操作。 若有其他方法可用，應避免使用針頭。 實驗室內，要穿著實驗衣，離開前要脫掉。 禁止對實驗性質不了解的人進入實驗室。 實驗進行中，要在實驗室之入口，標示P2級實驗室，並掛上P2級實驗進行中的標示。而且保存重組體之冰箱及冷凍庫也要做同樣的標示。 實驗室要經常清理，保持清潔，不得放置與實驗無關的物品。 安全操作裝置內的HEPA過濾器，在更換前、定期檢查時及實驗

25、內容變更時，需密封安全操作裝置，每立方公尺用10公克的甲醛燻蒸1小時，去除污染。 需遵守計畫主持人或實驗室負責人所規定之其他事項。,生物性材料危害警告標誌,基因重組實驗室安全防護標誌,P1及P2級實驗室比較表,隔間 P1:需要；進行實驗時宜關閉門窗 P2:需要完善隔間；進行實驗時須關閉門窗，如果能裝置UV燈及雙重門尤佳，否則門須為密閉式。 洗手設備 P1:需要 P2:需要(必須是能以足、肘或電子操作) 安全操作裝置 P1:實驗台(適當防污)，或用第一級安全箱櫃 P2:第一級或第二級安全箱櫃(若同時進行P1級實驗，需明確劃分實驗區域) 滅菌鍋 P1:不一定需要(如果有需滅菌的廢棄物，請裝在滅菌袋

26、，滅菌後才可丟棄) P2:需要(須在同一實驗室) 標示 P1:不需要 P2:需要(含冰箱、冷凍庫),生物安全等級第三級 - BSL3 or P3 Lab -,適用於有關會因吸入而造成嚴重致死的本土性或外來病原(RG3及RG4)的試驗，如臨床、診斷、研究或製造。 實驗室設施設施： 為獨立建築或單獨隔離的區域。 實驗室要密閉，設置緩衝區及雙門，雙門設定不可同時開啟，而且應有更衣室的設計。 實驗區域內需有廢水收集及滅菌之設備，高溫高壓滅菌箱需有雙門開啟(即穿牆式)。 牆壁、天花板及地板需防水及易於清潔。 需要密閉式供氣設備，單向氣流，空氣需向內流入實驗室方向(負壓)，每小時氣體交換十至十二次，廢氣不

27、循環。 具有Class I、II或III生物安全操作櫃。 人員訓練要求： 實驗室人員對處理致病性及致死性病原需有特別訓練，並受具對此病原有關的操作非常熟練的研究人員的監督。 視需要實施免疫措施，工作人員必須採集血清。 所有感染性物質的操作，必須在生物安全箱(Class I、II或III)中進行，工作人員亦須穿戴合適的防護衣。,P3級實驗室-實驗實施要項 -基因重組實驗室守則規定-,基本實施要項同P1和P2級實驗室。 進入此級實驗室需戴口罩、鞋套及帽套。實驗操作時，要使用實驗用手套。使用過之手套在作業完成之後，需在不污染其他物品的情況下脫掉，滅菌處理。 實驗區域內所穿著之實驗衣需為長袖且胸前不開

28、口，無鈕扣，從上向下套之形式。離開實驗區域時，需把實驗衣脫掉，滅菌處理後再行清洗。 實驗區域需從緩衝室進出，禁止與進行實驗無關之人員進入。 實驗進行中，要在實驗室及實驗區域之入口處，標示P3級實驗室，並掛上P3級實驗進行中的標示。而且保存重組體之冰箱及冷凍庫，也要做同樣的標示。,生物安全等級第四級 - BSL4 or P4 Lab -,適合第四級危害性病原體之有關實驗工作。 如P3實驗室規格。 在實驗區域內需具備兩套以上之發電設備，以使在電力供給不足時，可維持負壓狀態。 須於Class III的生物安全箱操作實驗，或Class I或II的生物安全箱再配上一套具陽壓工作服的條件下工作。 從第三級

29、安全操作裝置及實驗區域要把生物試驗材料在活的狀態搬出時，必需放在堅固不漏的容器，並且要通過浸漬槽或是燻蒸滅菌室。搬入時需做同樣的處理。,實驗室成員安全管理,基本的生物和化學實驗安全訓練 無菌操作技術訓練 儀器使用訓練和儀器使用紀錄 實驗物品清洗、準備、和滅菌訓練 第二級及以上病原的操作防護訓練 平時清潔維護工作 必要時，得於實驗前及計畫結束後，採集操作者血清，並作抗體測試。 必要時，得準備特定抗生素、抗病毒藥物、抗血清或疫苗備用。,管理制度的重要,前述實驗室感染個案 醫療院所群聚感染事件 竹東榮民醫院疑似發生退伍軍人病的群聚感染，其護理之家也發生Norovirus感染。 反映了護理、看護人員的

30、照護及衛生觀念有待加強。 院內空調設施的清洗，熱水管路的消毒。 振興醫學復健中心院內員工感染肺結核群聚事件。 合宜且易於執行的管理制度 安排合理的工作量，工作不宜太累。,儀器使用應注意事項,第一次使用前，須經資深人員講解，並詳讀使用手冊或接受訓練講習並考核通過： 如超高速離心機、高壓蒸氣滅菌鍋爐、放射性儀器、電泳設備、蒸餾設備等。 千萬不要只憑想像，或以往使用其他電儀器的經驗來進行操作。 注意儀器使用的電壓及接地。 使用前：注意儀器設定情形，和上次使用紀錄。 使用後：復原設定(即歸零)，並紀錄使用情形。,實驗室常發生的意外,觸漏電意外 地震：化學藥品墜落、實驗儀器傾倒等。 火災：如Oven過熱

31、、電線走火、酒精燈使用不當、化學反應爆炸等。 離心機使用不當導致的意外：如離心座未掛好、離心樣品未平衡、離心座腐蝕、低溫跑CsCl等密度離心等。 生物性材料污染,實驗室常發生的意外,酸、鹼、腐蝕性、毒性藥品所導致的傷害 如SDS、acrylamide、 phenol (酚)、CH3HgOH(氫氧化甲基汞)、EtBr等。 Phenol蒸餾時，不能以水來冷卻。 實驗桌面污染所導致的傷害 殘留化學藥物或病原性微生物。 切割所導致的傷害 紫外光(UV light)傷害 放射性同位素污染,Ethidium Bromide (EtBr)的處理,一種突變原(Mutagen)，用於核酸電泳染色 Less than 0.1% ethidium bromide: place in laboratory trash More than or equal to 0.1%: place in biohazard bags and tag for pickup and incineration Aqueous solutions containing 10 mg/ml EtBr can be rele