发酵过程的代谢控制.ppt

1、发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性,第一节 发酵过程工艺控制的目的、 研究的方法和层次,一 发酵过程的种类,分批培养 补料分批培养 半连续培养 连续培养,1、 分批发酵 简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期,在迟滞期，菌体没有分裂只有生长。,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期,随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速

2、率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期。,分批培养的优缺点：,优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握 缺点 产率低，不适于测定动力学数据,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。,补料分批培养的优缺点,优点 可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；,缺点 没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降;增加了染菌机会,3、半连续培养,在补料分批

3、培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,连续培养的优缺点,优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量,缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,二 发酵过程工艺控制的目的,有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来 目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率,发挥菌种的最大生产潜力考虑之点 菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强

4、度、营养要求（酶系统）、代谢速率 菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等,微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。,三 发酵过程研究的方法和层次,1、研究方法,单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验。,数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。 同时进行多因子试验。用少量的实验，

5、经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。,2、研究的层次 初级层次的研究： 一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。 摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。,代谢及工程参数层次研究： 一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。,生产规模放大 在大型发酵罐规模进行试验。将小型

6、发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。,第二节 发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛。 这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等,代谢参数按性质分可分三类： 物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧等 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等,从检测手段分可分为：直接参数、间接参数 直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等 间接参数：将直

7、接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等,直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数 在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速； 离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。,一 发酵过程主要分析的项目,目前发酵过程主要分析项目如下,1、pH pH与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况,2、排气氧、排气CO2和呼吸熵,排气氧的浓度反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。 排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况。,RQ值随微生物菌

8、种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料,CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量,呼吸熵,呼吸熵反映了氧的利用状况,一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态。 后期的补料控制是关键。,3、糖含量,微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。 糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力 糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。 还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡 萄糖。,4、氨基氮和氨氮,氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml

9、。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。 氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。 氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合 成情况。,5、磷含量,微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。 磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。,6、菌浓度和菌形态 菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。 菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。,7、产物浓度,在培养过

10、程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。,第二节 温度对发酵的影响和及其控制,微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。,一、温度对生长的影响,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,二

11、、温度对发酵的影响,1、温度影响反应速率,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。 从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得,E活化能,Kr速率常数,k=Aexp(- E/RT),2、温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。,(3) 温度基质溶解度,影响氧在发酵液中的溶解度 温度 溶氧 影响基质的吸收速率 如菌体对硫酸盐吸收在25时最小,三、最适温度的选择,所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的

12、生长或产物的合成。 对不同的菌种、不同的培养条件、不同的酶反应以及不同的生长阶段，最适温度有所不同。,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为370C， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C， 青霉菌生长温度为300C。,根据菌种,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速； 在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。,根据生长阶段选择,发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高

13、温度，刺激产物合成到放罐。,如四环素生长阶段28，合成期26后期再升温；黑曲霉生长37 ，产糖化酶3234 。 但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长3032，产酸3437。,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3、根据菌生长情况,菌生长快，维持在较高温度时间要短些；,菌生长慢，维持较高温度时间可长些。,培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。,四、发酵过程引起温度变化的因素,（一

14、）发酵热Q发酵,发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。 所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。,发酵热引起发酵液的温度上升。 发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。,1、生物热Q生物,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多 一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水,培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。 生物热的大小与呼吸作用强弱有关。 在培养初期，产生热量

15、较少。 菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，必须注意控制温度。 培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内 的酶系进行代谢作用，产生热量不多。,2、搅拌热Q搅拌,电机功率P=,E额定电压 I额定电流 cos功率因素，1千瓦时8604186.8焦耳,搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算： Q搅拌P8604186.8（焦耳/小时） P搅拌轴功率 4186.8机械能转变为热能的热功当量,3、蒸发热Q蒸发,通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。,4、辐射热Q辐射,发酵罐内

16、温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射,（二）发酵热的测定,有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。 Q发酵GCm(T出T进) Cm水的比热, G冷却水流量,另一种是根据罐温上升速率来计算。,五、温度的控制 一般不需加热，因释放了大量的发酵热，需要冷却的情况多。 用夹套或蛇形管，通冷却水。,第三节 发酵过程的pH控制,pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。,发酵过程中pH是不断

17、变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否。,一、发酵过程pH变化的原因,1、基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一. （2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 （3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,2、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3、菌体自溶 pH上升，发酵后期，pH上升。,二、pH对发酵的影响,例 p

18、H对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。 发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。,1、实例,pH,7.0,t,不调pH,调pH,效价,pH,2、pH对发酵的影响,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某

19、些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻,（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄。,（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢 物的解离，影响微生物对这些物质的利用 。,（4）pH影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。,3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌体生长影响比产物合成影响小,X,pH,四环素,三、pH的控制,1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后p

20、H在6.0，消前pH往往要调到6.56.8.,2、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。,3、通过补料调节pH,在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH 如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH (2)当NH2-N低，pH低时补氨水； 当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4,4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。,总结,小 结,发酵过程pH会发生变化,变化原因,基质代谢,产物形

21、成,菌体自溶,对发酵的影响,pH,pH影响酶的活性 pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变 pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离 pH影响代谢方向,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,pH的控制方式,基础培养基调节pH,在基础料中加入维持pH的物质,通过补料调节pH,当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,发酵的不同阶段采取不同的pH值,选择合适的pH调节剂,思考题 7.12 发酵过程中pH会不会发生变化为什么？ 7.13 pH对发酵的影响表现在哪些方面？ 7.14 为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验？ 7.15 发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？,第四节 氧的供需及对发酵的影响

22、,主要内容,一、细胞对氧的需求(为什么要供氧？为什么要控制溶氧？） 二、发酵过程中氧的传递（如何实现供氧？如何控制溶氧？） 三、影响氧传递的因素 四、摄氧率、溶解氧、KLa的测定 五、溶解氧对发酵的影响及控制,一、细胞对氧的需求,（一）氧在微生物发酵中的作用 （二）溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响 （三）影响耗氧的因素 （三）溶解氧控制的意义,（一）氧在微生物发酵中的作用（对于好气性微生物而言）,呼吸作用 直接参与一些生物合成反应,只有溶解状态的氧才能被微生物利用。,只考虑呼吸作用，则 C6H12O6H2O+CO2 能量 上式可知，180g葡萄糖完全氧化需要190g氧. 在常压下（25），

23、氧的溶解度仅为6.4mg /L 的溶解度小7000倍。只能保证氧化8.3mg葡萄糖，仅相当于常用培养基葡萄糖浓度的1。,在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。,微生物需氧量的表示方式,(1)呼吸强度（比耗氧速率） QO2 ：单位质量干菌体在单位时间内消耗氧的量。单位：mmolO2/（kg干菌体h）。 (2) 摄氧率（耗氧速率）：单位体积培养液在单位时间内消耗氧的量。 =QO2x x细胞浓度，kg(干重)/m3,呼吸强度表示微生物的绝对吸氧量，但当培养液中有固体成分存在时，测定困难。用耗氧速率(摄氧率)表

24、示.,QO2与溶氧浓度CL关系,QO2,CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。在临界氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。好氧微生物临界氧浓度大约是饱和浓度的1-25。,(1) 当CLCcr时， QO2 (QO2)m (2) 当CL Ccr时， k0： 亲和常数（半饱和常数）， 单位：mol/m3 k0特征： k0越大，亲和能力越小， QO2越小。 不同微生物的k0特征值不一样，可以此作为通气操作的依据。,一般对于微生物： CCr: 115%饱和浓度,例：酵母 4.6*10-3 mmol.L-1, 1.8% 产黄青霉 2.2*10-2 mmol.L-1,

25、 8.8%,定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度,所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1.,问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足?,例：以微生物的摄氧率0.052 mmol O2L-1S-1 计，在28氧在发酵液中的100的空气饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右 0.25/0.052=4.8秒,注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样,头孢菌素 卷须霉素 生长 5% (相对于饱和浓度） 13% 产物 13% 8%,（三）影响耗氧的因素,r= QO2 .X,r微生物摄氧率 mmol(O2)/Lh QO2呼吸强度 mmol(O2)/

26、g (干菌体) h X 菌体量 g (干菌体) /L,培养过程中细胞耗氧的一般规律,培养初期： QO2逐渐增高，x较小。 在对数生长初期：达到(QO2 )m，但此时x较低， 并不高。 在对数生长后期：达到m, D. 对数生长期末：S, QO2 而(QO2 , x), 虽然x=xm,但 QO2占主导地位，所以 E. 培养后期：S0，QO2 , ,影响微生物耗氧的因素,微生物本身遗传特征的影响，如 k0，QO2 培养基的成分和浓度 碳源种类 耗氧速率：油脂或烃类葡萄糖 蔗糖 乳糖 培养基浓度 浓度大, QO2 ; 浓度小, QO2 菌龄的影响:一般幼龄菌QO2大,晚龄菌QO2小,4. 影响微生物耗

27、氧的因素（续）,发酵条件的影响 pH值 通过酶活来影响耗氧特征; 温度 通过酶活及溶氧来影响耗氧特征：T , DO2 代谢类型(发酵类型)的影响 若产物通过TCA循环获取,则QO2高,耗氧量大 若产物通过EMP途径获取,则QO2低,耗氧量小,溶解氧浓度对细胞生长和产物合成的影响可能是不同的，所以须了解长菌阶段和代谢产物形成阶段的最适需氧量。 氧传递速率已成为许多好气性发酵产量的限制因素。 目前,在发酵工业上氧的利用率很低，因此提高传氧效率,就能大大降低空气消耗量,从而降低设备费和动力消耗,且减少泡沫形成和染菌的机会, 大大提高设备利用率。,（四）溶解氧控制的意义,二、氧在液体中的传递,1. 氧

28、传递的阻力 微生物发酵过程中，氧需克服从气态液体菌体多方面的阻力，才能参与各种生化反应,2. 氧得传递 传递推动力 根据双膜理论，传递过程的总推动力是气相与细胞内的氧分压之差 OTRKLa（C*- CL ） OTR 单位体积培养液的氧传递速率（kmol/m3 h） C* 与气相中氧平衡的饱和溶氧浓度（kmol/m3 ） CL溶液主流中的氧浓度（kmol/m3 ） KL 以氧浓度差为总推动力的总传质系数（kmol/（m2 hkmol/m3） a比表面积（单位体积液体中所含有的气液接触面积m2 /m3） 液相体积氧传递系数 因a很难测定，把KLa当成以一项，称为液相体积氧传递系数(以浓度差为推动力

29、的体积溶氧系数)，1/h,由气液传递速率方程,2. kLa的影响因素,（一）影响氧传递的因素,1. 影响推动力C*-CL的因素 影响比表面积a的因素 影响液膜传递系数kL的因素,可知，影响氧传递速率的因素（即影响供氧的因素）有：, 提高饱和氧浓度 考虑适当降温（T ，Cw* ，推动力） 降低基质浓度 考虑提高氧分压(提高罐压、富氧通气） 降低发酵液中的CL 考虑减少通气量或降低搅拌速度，降低KLa,提高氧传递推动力（C*CL）的方法,调节Kla是最常用的方法， kla反映了设备的供氧能力。,45升 1吨 10吨 搅拌速度 250 rpm 120 120 供氧速率 7.6 10.7 20.1,不

30、同的设备供氧能力不一样,提高KLa（液相体积氧传递系数）,发酵常用的设备为：摇瓶 发酵罐,（一）影响摇瓶kLa的因素,1) 摇瓶机的种类和装液量,摇瓶机,往复，频率80-120分/次，振幅8cm,旋转，偏心距25、12,转述250rpm,装液量，一般取1/10左右(好氧发酵）： 250ml 15-25 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml,例： 500 ml 摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响 装液量 30 ml 60ml 90ml 120ml 酶活力 713 734 253 92,（二）影响发酵罐中kLa的因素,(二）影响KLa的因素,发酵罐的形状，结构（几何参数） 搅

31、拌器，空气分布器（几何参数） 通气：表观线速度Vs 操作条件 搅拌：转速N，搅拌功率Pg 发酵液体积V，液柱高度HL 发酵液的性质：如影响发酵液性质的表面活性剂、离子强度、菌体量,设备参数,实际上：,对于转速的调节有时是有限度的,通风的增加也是有限的,蒸发量大,中间挥发性代谢产物带走,经验得出，对KLa的影响，搅拌功率远远大于空气流速,3、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点,小型发酵罐，转速可调,大型发酵罐，转速往往不可调,大型反应器的合理设计,对现有设备一定要注意工艺配套,5、影响Kla的其它因素,设备结构：如空气分布器（单孔鼓泡器，多孔环行鼓泡器）、挡板、罐体径高比等。,液体的粘度,泡

32、沫的影响,KLa与发酵液的粘度成反比关系，在发酵过程中，微生物不断改变发酵液基质浓度，菌丝形态，菌体浓度及产物浓度，进而改变发酵液粘度，使KLa处于动态变化之中，尤其是放线菌，霉菌的发酵液,搅拌和通气会带来发酵液的泡沫，泡沫会降低气液混合效率，降低KLa，应采取措施消除泡沫,三、溶解氧、摄氧率和KLa值的测定,（一）溶解氧CL的测定原理与方法 化学法 极谱法 复膜氧电极法,化学法,原理：在样品中加入硫酸锰和碱性KI溶液，生成氢氧化锰沉淀，与溶解氧反应生成硫酸锰，再在反应液中加入H2SO4, 释放出游离的碘，然后用标准Na2S2O3液滴定。 MnSO4+2NaOH Mn(OH)2十Na2SO4

33、2Mn(OH)2+O2MnO(OH)2 MnO(OH)2+Mn(OH)2MnMnO3+2H2O MnMnO3+3H2SO4+2KI2MnSO4+I2+3H2O+H2SO4 I2+2Na2S2O32NaI十Na2S4O6,（1） 化学法（续）,优点：测定较准确，且能得到氧的浓度值。 缺点：当样品中存在氧化还原性物质，测定结果会有偏差；当样品带有颜色时，会影响测定终点的判断，故不适合测定发酵液的溶解氧浓度。,（2）极谱法,原理：给浸在待测液体中的贵金属阴极和参考电极（阳极）加上直流电压，当电解电压固定在0.8V左右时，与阴极接触的液体中的溶解氧发生如下氧化还原反应而被消耗， 酸性时 O2+2H+2

34、e H2O2 中性或碱性时 O22H2O +2e H2O22OH,原理： 阴极表面与液体的主体之间存在氧的浓度差，于是液体主体的溶解氧就会扩散到阴极的表面参加电极反应，使电路中维持一定的电流。当氧的扩散过程达到稳定状态时，溶解氧浓度与测得的扩散电流成正比。,氧浓度与扩散电流的关系,（2）极谱法,阴极表面极易被污染，影响重现性，所以一般采用滴汞电板作为阴极（工作电极），阳极（参比电极）则可用甘汞电极。 如果样品中含有其它的氧化还原性物质会影响电极反应，从而影响到该法的准确性，使测定结果有误差。,（3）复膜氧电极法,复膜氧电极类型：极谱型；原电池型 原理：复膜氧电极测得的实际为氧从液相主体到阴极的

35、扩 散速率。当扩散过程达到稳定状态时，单位面积氧的扩散速率为： no2=kL(PL-P1)=km(P1-P2)=ke(P2-Pc)=K(PL-Pc) 根据Faraday定律，原电池型氧电极的稳定电流为： i=4FAno2= 4FAK(PL-Pc)=KPL 溶氧电极测定的实际是氧从液相主体到 阴极的扩散速率。,复膜氧电极示意图,（a）极谱型 （b）原电池型,复膜氧电极内外氧电压的分布,c,（二）摄氧率的测定原理与方法,瓦氏呼吸仪法 物料衡算法 氧电极法,KLa的测定原理与方法,亚硫酸盐氧化法 取样极谱法 物料衡算法 动态法 排气法 复膜电极法,（五）溶解氧对发酵的影响及其控制,1. 引起溶解氧变

36、化的因素 2. 溶解氧对发酵的影响 3. 溶解氧在发酵过程控制中的重要作用 4. 发酵液中溶解氧的控制 5. 溶解氧控制实例,（1）影响溶解氧（DO）的因素,供氧 耗氧,两大类,以关系式表示： 影响供氧的因素： 影响耗氧的因素：,C*- CL,温度、溶质、溶剂、氧分压,KLa,设备参数、操作参数、发酵液特性,菌种特性、培养基成分和浓度、菌龄、培养条件（T、pH）、代谢类型,（2）发酵过程中溶氧变化规律,批式发酵无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象”,溶氧、x、QO2、 随时间变化的关系,平衡点分析： 当CL，即 ，OTR ， OTR逐渐至OTR=，即 ，高位平衡 当处于高位平衡时，表明供

37、氧性能好。高位平衡通常发生在正常情况的前、后期。,平衡点分析： 当CL（如对数生长期很大）， ，OTR ， ， ，称低位平衡。 低位平衡通常发生在正常情况下的对数期。,值得注意的几点,自然“波谷现象”，一般可以自适应调节（ ） 当 ，则需要控制，增加OTR，防止需氧受阻。 补料与“波谷现象”对应：即补料时间、剂量选择与溶氧变化有关。 a.不能在波谷时补料，加重缺氧 b. 一次补料不能过量，防止 ， 菌体停止呼吸、死亡 c.每次补料都会引起一次大的溶氧下降。,（1）溶解氧对生长的影响,临界氧浓度（CCr）： 当 时, 当 时, 对生长应满足 , 但并不是越高越好,呼吸抑制,呼吸不受抑制,指不影响

38、菌体呼吸所允许的最低 氧浓度。,（2）溶解氧对产物合成的影响,最适氧浓度（Cm）：溶氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利。 e.g.卷须霉素：1270h之间，维持CL 在10%比在0或45%的产量要高。,（3）CCr与Cm比较：通常Cm与CCr不一致,对于某些菌株 CcrCm, 卷须霉素: 而有些菌株 Ccr Cm, 头孢菌素C：,Cm 8%,生长阶段要求CL CCr，生产阶段满足CLCm。,（1）发酵异常指标,发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。 对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。 对于厌气性杂菌，溶解氧升高。 污染噬菌体或其

39、它不明原因引起 发酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。 操作故障或事故分析,（2）补料控制指标,中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。 发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。,（3）代谢方向控制指标,测量溶解氧可以确定CCr、Cm值 通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机 e.g.天门冬酰胺酶发酵：45%饱和度 在酵母以及其他微生物菌体的生产中，溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一 。,（4）设备性能、工艺合理性指标,评价设备性能、工艺合理性的最终指标：发酵单位 设备反映供氧性能： 搅拌桨形式 叶片形式 搅拌器直径d 搅拌档数m和搅拌器间距s 档板宽度w和档板数z 通气：空气

40、分布器的类型和位置 n，P/V 设备操作参数 罐压 WS或VVM,（4）设备性能、工艺合理性指标,工艺条件反映耗氧和供氧特征 菌种性能：耗O2 培养基性能：耗O2、供O2 温度：耗O2、供O2 RQ（O2与CO2水平比较）：耗O2 表面活性剂：耗O2、供O2,改进工艺：控制补料速度、T 的调节、中间补水、 添加表面活性剂等等,工艺的改进是否有效可通过溶解氧水平进行评价： P/V的改变对溶解氧和产量的影响 e.g.利福霉素发酵：5080h波谷阶段，P/V，KLa，供氧；3W/L比1 W/L批号的发酵单位增加约900u/ml 搅拌转数n 对溶解氧和产量的影响 e.g.赤霉素发酵：15 50h期间，

41、n从155 提高至180r/min， 赤霉素单位,（1）溶解氧控制的一般原则,生长阶段： 即可 产物合成阶段： 即可 过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用,（2）溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一,控制原理 发酵过程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。 对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。,，加大补糖速率,，减小补糖速率,实现用溶解氧水平控制补料速率,补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KL

42、a水平所能提供的最大供氧速率。,控制原则,（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一,控制方法 溶氧和补糖控制系统 溶氧和pH控制的系统,（2）溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一,（3）溶解氧控制的工艺方法：从供氧、需氧两方面考虑,供氧方面： 提高氧分压（氧分含量），即 ，提高供氧能力 改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力 通气速率Ws ：Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫 提高罐压： ，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。,改变发酵液理化性质（， ，Ii） 加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分改变KL 改变温度： ，提高推动力（C*CL

43、）,（3）溶解氧控制的工艺方法（续）,供氧方面：,（3）溶解氧控制的工艺方法,耗氧方面 限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度限制、x 限制 控制溶解氧,（4）溶解氧自动控制系统,改变通气速率的溶氧控制系统 改变搅拌转速的溶氧控制系统 改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统,第五节CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制,一、二氧化碳对发酵的影响 二、呼吸商与发酵的关系 三、 发酵过程中CO2释放率的变化 四、 CO2对发酵的影响,一、二氧化碳对发酵的影响,CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的一种基质，它是细胞代谢的重要指示。 CO2的抑制作用：影响

44、菌体生长、形态及产物合成大多数微生物适应低CO2浓度（0.020.04%体积分数）。当尾气CO2浓度高于4%时微生物的糖代谢与呼吸速率下降。,CO2对菌体生长及产物形成的影响,CO2, 基质分解速率，ATP ，中间产物或形态变异导致产量 高浓度CO2抑制作用的独立性: 只要CO2在培养液中浓度过量，即使供氧充足（CLCCr），CO2的抑制作用不能解除，这种负作用在放大过程更明显。,CO2对细胞的作用机制： CO2 主要作用在细胞膜的脂肪酸核心部位 影响磷脂、亲水头部带电荷表面及细胞膜表面上的蛋白质,当细胞膜的脂质相中CO2浓度达到一临界值时，膜的流动性及表面电荷密度发生变化。 这将导致膜对许多

45、基质的运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，生长受抑制，形态发生变化。,呼吸商与发酵的关系1. 定义,呼吸商（RQ）：指菌体呼吸过程中，CO2释放率和菌的耗 氧速率之比，RQ反映菌的代谢情况。 菌体耗氧速率 OUR，molO2/Lh 菌体CO2释放率CER，molCO2/Lh,呼吸商：,RQ值可以反映菌的代谢情况，例如酵母培养过程： RQ=1 糖代谢走有氧分解代谢途径，仅供生长、无产物形成； RQ1.1 走EMP途径，生成乙醇； RQ=0.93 生成柠檬酸； RQ0.7 生成的乙醇被当作基质再利用。, 菌在利用不同基质时，其RQ值也不同；, 在抗生素发酵中在生长、维持和产物

46、形成阶段的RQ值也不一样。,大肠杆菌 延胡索酸1.44 丙酮酸1.26 葡萄糖 1.0,2、影响尾气中CO2浓度的因素,通入空气量： 呼吸强度： CO2溶解度： 菌体量：,3、CER变化规律,CO2积累量渐增，与x曲线对应，基本类似S型曲线变化； 当工艺和设备参数一定的情况下，CER与x有比例关系（CER菌体生长速率）； CO2浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系。,CER的测量与计算,测量方法：热导、红外分析仪、气相色谱 计算,研究参数CO2的意义,作为代谢产物或中间前体，尾气中CO2积累与生物量 成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。 高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与

47、 控制； 尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。,CO2释放与发酵过程参数pH及操作参数补糖速率的关系,在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加，同时pH下降。 糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感，所以测定排气CO2释放率 （CER）来控制补糖速率。 补糖与溶氧及pH协同控制 补糖速率与CER控制,补糖对排气CO2和pH的影响,青霉素发酵不同阶段： 菌体生长阶段：RQ0.909 维持阶段：RQ=1 生产阶段：RQ=4 如果产物的还原性比基质大时，其RQ值就增加；反之，当产物

48、的氧化性比基质大时，RQ值就要减少，其偏离程度决定于单位菌体利用基质形成产物的量。,产物形成对RQ影响最大,二氧化碳浓度的控制,发酵液中CO2浓度受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小和设备规模等。值得注意的是，罐内的CO2分压是液体深度的函数。 CO2浓度的控制：根据其对发酵的促进或抑制作用，通过调节通气量和搅拌速率，提高或降低其浓度。,第六节 发酵过程基质代谢及控制,基质代谢的规律是什么？ 如何控制基质浓度，达到产物合成的最佳化？,一 基质浓度的变化,1、碳源代谢,碳源是培养基中含量最多的成分，也是最主要的成分。 从微生物细胞组成来看C、H、O、N

49、的比例 林可链霉菌细胞化学组成为 C1000H1680N240O500P17,发酵过程中有总糖和还原糖二个参数 还原糖中大部分是易利用的葡萄糖，而总糖包括还原糖及其他要分解后才能被利用的糖。 发酵培养基往往是快速利用的和缓慢利用的碳源相搭配。 微生物糖代谢特点：总是先利用易利用的碳源，待易利用的碳源快消耗完，才开始利用缓慢利用的碳源，因此从碳代谢曲线来看，常常会出现二段生长的情况,结论 微生物首先利用容易利用的碳源，在易利用碳源浓度降低到一定水平再合成相关酶利用缓慢利用的碳源。 微生物的酶合成是经济的,2、氮代谢,氮源也有快速利用的氮源和缓慢利用的氮源,快速利用 铵盐、氨基酸,缓慢利用 蛋白质

50、分解成氨基酸 硝酸盐还原成铵,微生物体内硝酸盐不能直接被利用，必需先转化成还原态氮。 微生物能够利用的是高度还原态的氮，即可以利用氨，其化合价是3。而硝酸盐处于高度氧化状态，其中氮原子的化合价是5。当以硝酸盐为氮源时，它必须先还原成氨后才能用于生物合成。,和碳源利用相同，微生物先利用容易利用的氮源再利用缓慢利用的氮源。 氮源的代谢规律是：随着菌体生长，氮源被利用，氨基氮和氨氮都下降，到中期下降缓慢，并有一段时间维持在一定水平，到发酵后期，由于菌体衰老自溶，放出氨基氮，使氨基氮上升。,3、磷代谢,磷含量随着发酵的进行不断减少。 磷对菌体合成有促进作用：促进糖代谢，在有氧情况下，糖代谢走HMP途径

51、，葡萄糖葡萄糖6磷酸葡萄糖酸6磷酸戊糖磷酸合成核酸,磷浓度对链霉素产生菌葡萄糖利用的影响 加磷量（M）以K3PO4计 利用葡萄糖的量(mg/ml) （pH=7.3） 0 0.62 0.001 0.92 0.002 1.24 0.01 1.64,磷对产物合成有抑制作用： 磷多会抑制磷酸酯酶，使一些非活性的抗生素磷酸盐不能脱去磷酸而成为有活性的终产物。 磷多使糖代谢走三羧酸循环，使某些产物合成所需的前体量减少。如四环素合成需要丙二酰CoA、乙酰CoA，磷多了使这些前体进入三羧酸循环，减少了前体。因此代谢中只有当磷减少到一定水平才开始合成抗生素。,发酵的中后期营养物消耗造成微生物所需营养缺乏，我们应

52、采取什么措施？,增加基础料的营养成分含量 一定阶段补入必要的营养成分,二 发酵控制与中间补料,中后期营养不足，菌体过早衰老 初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大 初始培养基中葡萄糖过多引起抑制 代谢后碳氮源不平衡、微量元素缺乏 合成的产物或中间体积累的毒性,方法：采取较低浓度的基础培养基，待菌体生长到一定阶段，补入适当营养物，延长发酵的产物合成期。 意义：控制菌的生长速率，并控制产生菌培养中期的代谢活动，延长合成期，推迟菌体自溶，加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。,（一） 中间补料的意义及原则,中间补料就是在发酵过程中，补充某些营养物料，满足产生菌的代谢活动和产物合成的需要。

53、补料原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中期的生化代谢活动向着有利于产物合成和分泌的方向发展。,补料内容：碳源、氮源、前体、无机盐或水,（二） 补料控制,1、补充微生物所需的能源和碳源,碳源是微生物长菌体时需要量最大的物质，在发酵前期消耗很快，到了产物合成阶段菌体要维持活性必须补充碳源，以便延长产物合成期。,例 谷氨酸：在原工艺的基础上，减少初糖浓度，增加生物素用量达5g/l，加大接种量到10%左右，以利于菌体迅速繁殖，获得生产需要的足够量的菌体。 当进入产酸期，糖耗达2%左右，连续补糖，维持2%左右的糖浓度，提高温度36370C，流加氨水或尿素，维持pH7.07.5，利用菌体所形成的酶

54、系继续进行发酵，产酸可达10%。 后来补糖方法在抗生素发酵中普遍采用。,补糖控制考虑：补糖时间、补糖量、补糖方式,参考数据：糖耗速率、残糖浓度、pH变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液粘度、溶氧浓度等指标 根据还原糖水平，如赤霉素还原糖降到0.6就需要补糖， 根据总糖水平，根据菌的酶系和pH变化的大小决定。 注意：不同的发酵阶段控制的残糖浓度不同,补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗；补糖过迟会使菌体所需要的能量供应跟不上，干扰菌的代谢。 例：四环素 补糖时间 96h效价 20h 6000u/ml 45h 10000u/ml 62h 6000u/ml,补糖时间,说明 开始补糖的时间

55、必须根据代谢的变化情况来决定，根据基础培养基的碳源种类及用量、菌丝生长情况、糖的消耗速率及残留水平来综合考虑，不能单纯以时间为依据。,补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以利于产物合成，但高浓度的还原糖不易维持过久，否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还原糖水平维持在0.81.5之间较为合适。,补糖量,补料方式可分为：连续流加 少量多次 大量少次 连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。,补料方式,在培养过程中以恒定的流速加入葡萄糖 好处：解除了底物抑制、产物反馈抑制

56、和葡萄糖阻遏效应，结果延长了菌体的生长周期，增加了菌体浓度和GSH产量，图2表示了恒速流加的实验结果,恒速流加培养,指数流加补料分批培养,理由：恒速流加过程，由于葡萄糖流加的速度始终恒定，在发酵的前期菌体浓度低，葡萄糖难以完全消耗，而在发酵的后期，菌体浓度很高，葡萄糖又不能满足菌体生长的需要，因此采用指数流加的方式有利于菌体的生长，图3表示了指数流加的实验结果。,恒pH补料分批培养模式,根据培养基pH的变化流加40g/L的葡萄糖，当pH降低时，加入碱液调节pH，达到设定的数值，根据糖的消耗加入适量的葡萄糖，由于葡萄糖的分解使pH下降，当pH下降到一定程度之后，则又加入适量的碱液使pH升高，如此

57、反复。发酵液中始终保持在较低的葡萄糖浓度。至60h流加结束，72h培养结束。,在发酵过程中，补充某些营养物料，满足产生菌的代谢活动和产物合成的需要。,中间补料,控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中期的生化代谢活动向着有利于产物合成和分泌的方向发展。,补料原则,碳源、氮源、前体、无机盐或水,补糖控制考虑：补糖时间、补糖量、补糖方式,补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗；补糖过迟会使菌体所需要的能量供应跟不上，干扰菌的代谢。,补料内容,补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。,补料方式,连续流加、少量多次、 大量少次 连续流加效果最好，可以

58、避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。,2、补充微生物所需的各种氮源,补氮是发酵控制的另一个重要项目，主要作用是调节pH和补充产生菌所需的氮源，从而控制代谢活动。,补充有机氮源 补充无机氮源 通氨、补硫酸铵,生产上补氮有两种：,（1）补充有机氮源,添加某些具调节生长代谢作用的有机氮源如尿素、酵母粉、蛋白胨、玉米浆，保持菌的活性，补充产物合成所需的氮源,有时与碳源一起配合补料，工厂称作补混合料,例：土霉素发酵前期补23次酵母粉，放罐单位比对照高1500u/ml。 青霉素发酵47小时开始加尿素，每6小时补加一次，结合补加乳糖，发酵单位可达40000u/ml以上。 赤霉素生产补加的氮源是花生粉，配16的花生粉液体，当菌生长到粘度大于15cps时，说明氮源被消耗很多，就开始补加花生粉。对于含氮的产物的生产特别需要补氮。,补料依据：氨基氮的消耗、菌的浓度、pH,pH,t,在谷氨