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文档简介

1、实用免疫细胞与核酸 课件模板-17,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,形态学研究目的之一是揭示组织细胞结构特征及其功能意义。利用ICC显示给与细胞增殖标记物,是组织细胞学研究中形态和功能相结合的重要手段之一。目前常用的细胞增殖标记物有4种,Brdu (5bromo2-deoxyuridine), DNApolymerase ,PCNA (Proliferating cell nuclear antigen),Ki67 等,相对应的4种单克隆抗体均有商品出售。,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中

2、的应用:,因组织细胞内无内源性Brdu存在,所以Brdu应用较广。Brdu为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,笔者在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时,一次腹腔注射Brdu(Sigma)4mg/150200g体重,分别在给药后1h和1、2、3、5、7天取小肠,应用抗Brdu抗体,ICC染色,可见肠上皮细胞从肠腺至

3、绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中,一次注射Brdu后,计数瞬间进入S期细胞数或连续多次注射Brdu,计数注射Brdu期间进入S期细胞的总和。,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,另外在临床上,术前或术中给与Brdu,判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。 掺入双链DNA内的Brdu,以氢链与腺嘌呤结合,不能直接与抗Brdu抗体反应,需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等,使DNA双链部分单链化,抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合,再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色,显示进入S

4、期细胞的情况。,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此,Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体(Bu1),其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应,因为培养液上清中含有DNA酶,可分解双链DNA,显露Brdu,达到染色目的。笔者采用戊二醛固定后,胃蛋白酶盐酸处理,亦得到了良好的染色结果。,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,简述染色步骤如下(Matsuna,1989): (1)冰冻切片/石蜡切片准备同前。 (2)TBS

5、冲洗,Bakers液固定10min,室温。 (3)TBS冲洗,1%戊二醛固定510min,室温。 (4)双蒸水冲洗,0.006%(冰冻切片)或0.02%(石蜡切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37,10min。,实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,(5)双蒸水冲洗,4N HCl 30min,室温。 (6)PBS充分冲洗,使切片pH回至中性。 (7)封闭性阻断剂20min,室温。 (8)抗Brdu抗体孵育12h室温或4过夜。 (9)PBS冲洗,HRP标记抗小鼠IgG抗体45min,室温。 (10)PBS冲洗,DAB/H2O2呈色。,

6、实用免疫细胞与核酸:三、ICC在细胞功能研究中的应用,三、ICC在细胞功能研究中的应用:,(11)轻度苏木精复染,脱水透明,封片同前。分裂增殖细胞核呈棕褐色。 采用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时,首先应染色其它抗原物质,最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后,再经1%戊二醛固定510min,重复上述程序,均可获得较满意的染色结果,分裂细胞核呈棕褐色;显示其它抗原用ALP标记抗体,则细胞浆为红色(FR)或蓝色(FB)。,实用免疫细胞与核酸:四、 ICC在原位杂交技术中的应用,四、 ICC在原位杂交技术中的应用:,传统的ICC法主要用于检测组织细胞中含有何种物质,根据该物质的作用,推测其

7、组织细胞生理、病理意义。但该物质来自何处,是否是阳性细胞合成往往较难判断,结合免疫电镜及双重染色等方法,在某种程度上,有助于推断该物质的来源。然而通常ICC法显示的是组织细胞已经合成的物质(过去时),本身不能说明阳性组织细胞目前的功能状态,亦无法预测细胞将合成何种物质,发挥什么功能,因此,单纯的ICC法存在着被动性。,实用免疫细胞与核酸:四、 ICC在原位杂交技术中的应用,四、 ICC在原位杂交技术中的应用:,近年来,ICC法与原位杂交技术结合,使细胞内活性DNA可视化,直接显示某染色体上,何种基因活性化或非活性化,描述组织细胞现在的状态,同时亦可预知未来组织细胞将合成何种物质,发挥哪些功能等

8、,直接观察组织细胞的时空改变,这在病理生理研究中有着重要意义,为形态学研究开辟了令人瞩目的前景。,实用免疫细胞与核酸:四、 ICC在原位杂交技术中的应用,四、 ICC在原位杂交技术中的应用:,众所周知,机体内不同的蛋白质发挥其特定的功能,与其氨基酸序列密切相关,而它的氨基酸序列又是DNA通过mRNA转录控制的。因此检测该DAN/mRNA的分布,可判断组织细胞的功能状态。为在组织细胞水平检测DNA/mRNA等一定碱基序列的核酸存在与否,Gall(1969)等建立了原位杂交方法(详见第二十章)。,实用免疫细胞与核酸:四、 ICC在原位杂交技术中的应用,四、 ICC在原位杂交技术中的应用:,在检测某

9、种特定的蛋白质在哪一类细胞内合成时,常常应用连续切片或镜影切片,原位杂交法显示合成该蛋白质的mRNA,ICC法染色其蛋白质抗原,二者存在于同一细胞时,具有较强的说服力。同一切片进行上述双重染色时,原位杂交步骤中,大多数抗原物质的抗原性往往易被破坏,所以最好在ICC染色后再进行原位杂交染色。,实用免疫细胞与核酸:四、 ICC在原位杂交技术中的应用,四、 ICC在原位杂交技术中的应用:,ICC染色中,抗体内含有RNase等可能破坏细胞内的mRNA,为此应选用精制IgG抗体,并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖,其化学性质与核酸类似,能够与以核酸为底物的酶(RNase)结合,从而保

10、护mRNA免受破坏。另外,ICC染色以DAB呈色时,核酸探针易吸附于DAB产物上,需注意。,实用免疫细胞与核酸:四、 ICC在原位杂交技术中的应用,四、 ICC在原位杂交技术中的应用:,近年随着细胞工程的进步,ICC、原位杂交技术将在细胞生物学、组织学、遗传学、病毒学、临床疾病诊断等各个领域,得到更广泛地应用。,实用免疫细胞与核酸:参考文献,参考文献:,1.BigbeeJW,et al . Effects of primary antiserum dilution on staining of antlgen richtissue with the peroxidase antiperoxid

11、ase technique. j Histochem Cytochem. 1977;25:433447 2.BorrsmaDM. Preparation of HRP Iabelled antibodies。,实用免疫细胞与核酸:参考文献,参考文献:,In Cuello AC(ed) lmmunohistochemistry, JohnWiley&,Sons, New York :Brisbane Toronto Singapore, 1983:87100 3.ConchoroffNJ, et al . A monoclonal antibody reactive with 5Boromo2

12、deoxyuridine thatdoes not requireDNA denaturation。,实用免疫细胞与核酸:参考文献,参考文献:,Cytometry,1985;6t506512 4.CostaM, et al. Immunohistochemical localization of polypeptides in peripheralautononic nerves using whole mount preparation, Histochemistry, 1980;65:157165 5.CummingR. Cyclic nucleotide losses during ti

13、ssue processing for immunohistochemistry。,实用免疫细胞与核酸:参考文献,参考文献:,j HistochemCotychem, 1980j28:5455 6.GallJG, Paudue M. Formation and detection of RNADNa hybrid molecules incytological preparations. Proc Natu Acad Sci USA, 1969:63,378383 7.GrzannaR, Light microscopic immunocytochemistry with fixed unem

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15、ibody horseradish peroxidaseconjugates prepared by using maleimide compound,glutaraldehyde and periodate. JBiochem, 1982 j 4:4157 10.Li CY,et al. Use of azide and hydroRen peroxide as an inhibitor for endogenousperoxidase in the immunoperoxidase method , J Histochem Cytochem, 1987;35: 14571640 11.Ma

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17、plication for thelocalization of antigens。,实用免疫细胞与核酸:参考文献,参考文献:,j Histochem Cytochem, 1966;14:929931 13.NorrdenSV, Polak JM. Immunocytochemistry today techniques and practice, In PolakJM&Norrden SV(eds.) Immunocytdchemistry. London:Wright PSG Bristol, 1983:1142 14. OiVT, Herzenberg LA. Imrnunoglobul

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20、ergerLA, et al . The unlabelled antibody enzyme method of immunohistochemistry.Preparation and properties of soluble antigen antigody complex (horseradishperoxidse antihorseradish peroxidase ) and its use in the identificationspirochetes, J Hsitochem Cytochem, 1970;18:315333 18.Sternberger LA, Immunocytochemistry。,实用免疫细胞与核酸:参考文献,参考文献:,New York:John Wiley&Sons, 1979 19.Sternbe

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