粮油检测粮食中伏马毒素B1B2的测定超高效液相色谱方法征求意见稿

1、ics点击此处添加中国标准文献分类号中华人民共和国粮食行业标准ls/t xxxxxxxxx粮油检测 粮食中伏马毒素b1、b2的测定 超高效液相色谱方法inspection of grain and oilsdetermination of fumonisins b1、b2 in grains by ultra-high performance liquid chromatography点击此处添加与国际标准一致性程度的标识xxxx - xx - xx发布xxxx - xx - xx实施发布前言本标准按照gb/t 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术

2、委员会（sat/tc 270）归口。粮油检测 粮食中伏马毒素b1、b2的测定 超高效液相色谱方法1 范围本标准规定了采用免疫亲和柱净化超高效液相色谱法测定谷物及其制品中伏马毒素的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷等粮食及相关制品中伏马毒素的测定。本标准方法伏马毒素b1 、b2的检出限为0.05 mg/kg。2 原理试样中的伏马毒素经甲醇-水提取, 提取液经过滤、稀释后，利用免疫亲和反应净化，以邻苯二甲醛柱前衍生伏马毒素为荧光化合物，用反相快速高效液相色谱进行分离、检测，外标法测定伏马毒素b1和b2的含量。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合gb/t 66

3、82中一级水的要求。3.1 试剂3.1.1 甲醇，色谱纯。3.1.2 乙腈，色谱纯。3.1.3 四硼酸钠，分析纯。3.1.4 氯化钠，分析纯。3.1.5 磷酸氢二钠，分析纯。3.1.6 磷酸二氢钾，分析纯。3.1.7 氯化钾，分析纯。3.1.8 浓盐酸，分析纯。3.1.9 乙酸，色谱纯。3.1.10 邻苯二甲醛（opa），分析纯。3.1.11 2-硫基乙醇，分析纯。3.2 试剂配制3.2.1 0.1 mol/l四硼酸钠溶液：称取3.8 g四硼酸钠（3.1.3），用水溶解并定容至100 ml。3.2.2 2 mol/l盐酸溶液：将1体积浓盐酸（3.1.8）溶解在5体积水中。3.2.3 乙腈/水溶

4、液（50:50）：取50体积乙腈（3.1.2）加入50体积水。3.2.4 磷酸盐缓冲液（pbs）将8.0 g 氯化钠（3.1.4）、1.2 g磷酸氢二钠（3.1.5）、0.2 g 磷酸二氢钾（3.1.6）、0.2 g 氯化钾（3.1.7）溶解于990 ml水中，用2 mol/l盐酸溶液（3.2.2）调节ph值为7.0，最后定容为1 l。3.2.5 1%乙酸水溶液：量取99体积水，加入1体积乙酸（3.1.9）。3.2.6 opa衍生液取40 mg 邻苯二甲醛（3.1.10）加入1 ml甲醇溶解，加入0.1 mol/l 四硼酸钠溶液（3.2.1）5ml稀释，加入2-硫基乙醇（3.1.11）80 m

5、l，混匀。过0.22um滤膜后，存于具塞棕色瓶中，室温避光处可以储藏1周。3.2.7 2%乙酸化甲醇：量取98体积甲醇（3.1.1），加入2体积乙酸（3.1.9）。3.3 标准品3.3.1 伏马毒素b1和b2标准品：晶体，纯度95%；或伏马毒素有证溶液标准物质。3.4 标准溶液配制3.4.1 伏马毒素标准储备液使用伏马毒素有证溶液标准物质；或准确称取适量伏马毒素b1和b2标准品（3.3.1），用乙腈/水（3.2.3）溶解，配制成伏马毒素b1、b2浓度为100 mg/ml的混合标准储备液。该标准储备液在4下，可以稳定储藏6个月。3.4.2 伏马毒素标准储备液准确吸取适量伏马毒素b1、b2标准储备

6、液，用乙腈/水（3.2.3）定容，摇匀，获得伏马毒素b1、b2浓度为10 mg/ml的混合标准液。3.4.3 伏马毒素标准工作溶液分别取适量伏马毒素混合标准液（3.4.2），用乙腈/水（3.2.3）稀释成5个浓度梯度的伏马毒素标准工作溶液。使溶液中伏马毒素b1、b2浓度为0.1、0.25 、0.50、1.00 、2.00、5.00 mg/ml。3.5 材料3.5.1 快速定性滤纸：f12 cm whatman 4号1) whatman 4号为适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示本标准对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，可经实验评估后使用这些等效的产品，下

7、同。，或相当者3.5.2 滤膜：0.22 mm，有机系3.5.3 玻璃微纤维滤纸：f9 cm whatman gf/a，或相当者3.5.4 伏马毒素免疫亲和柱：对伏马毒素b1和b2均有100%的交叉反应性3.5.5 玻璃注射器：10 ml和20 ml3.5.6 50ml离心管4 仪器和设备4.1 快速高效液相色谱仪：配备荧光检测器和数据处理系统4.2 天平：感量0.01 mg4.3 谷物粉碎机4.4 空气压力泵4.5 氮气吹干仪4.6 高速均质器4.7 离心机4.8 多功能振荡器4.9 泵流操作架5 分析步骤5.1 试样制5.1.1 提取将样品用谷物粉碎机磨细至粒径小于1 mm（全部通过1 m

8、m孔径的试验筛），称取25 g (精确到0.1 g )试样，置于均质杯中，加入100 ml（v1）乙腈/水（3.2.3），高速提取2分钟或者多功能振荡器3000转/min，振荡提取30min，用定性滤纸（3.5.1）过滤或转移25ml的提取液于50ml的离心管中，5000r/min，离心5min。取1.5 ml（v2）滤液，加入35 ml （v3）pbs缓冲液（3.2.4）稀释，混匀，5000 r/min，离心5min。5.1.2 免疫亲和柱净化将免疫亲和柱与玻璃注射器下端连接。将全部36.5 ml（v4）上述稀释液通过亲和柱，调节流速使其保持约1 ml/min 2 ml/min，弃掉流出液。

9、再分别以10 ml pbs缓冲液（3.2.4）、10ml 水清洗亲和柱，直至液体完全流出，空气通过，弃掉全部流出液。分3次加入1ml酸化甲醇（3.2.7）将亲和柱中的伏马毒素洗脱，控制流速为1 ml/min 2 ml/min，收集洗脱液，55下用氮气吹干，测定前准确加入乙腈/水溶液（3.2.3）500 ml（v）溶解残留物，过0.22 mm滤膜（3.5.2），备用。*注：由于不同厂商提供的亲和柱操作程序可能有所不同，实际操作时，也可参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和程序使用。5.1.3 衍生化反应分别取上述净化液和标准工作溶液（3.4.3）各100 l，置于带内插管的样品瓶中，加入相同体积的o

10、pa衍生液，混合均匀后，静置3 min，进样分析。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱柱：c18 柱,50 mm3 mm，1.7m,或相当者。5.2.2 柱温：30。5.2.3 流动相：a：1%乙酸水溶液（3.2.5），b：乙腈（3.1.2）。等度洗脱，a：b=50:50。5.2.4流速：0.2 ml/min。5.2.5 进样量：2 l。5.2.6 荧光检测波长：激发波长310 nm、发射波长435 nm。5.3 标准曲线的制作在上述色谱条件下，等基线平稳后制作标准曲线。分别吸取伏马毒素各标准溶液进行衍生，3min后进样分析，得到伏马毒素标准液相色谱图。参考谱图见附录a。以标准工作溶液中伏马毒

11、素浓度为横坐标，相对应的色谱峰峰面积为纵坐标，建立伏马毒素b1、b2的标准曲线。5.4 试样溶液的测定吸取样液进行衍生，3min后进样分析。比较样品与标准品的色谱图，根据保留时间定性，根据峰面积用标准曲线定量，得到样液中伏马毒素b1或b2的浓度。吸取流动相进行衍生，按前步骤进行分析得到空白试样的浓度为。如果伏马毒素的浓度超过了所制作的标准曲线浓度范围，用乙腈/水溶液（3.2.3）将净化液稀释f倍后，重新进行衍生化反应和色谱分析。6 分析结果的表述样品中伏马毒素b1或b2的含量，按式、(2)计算： 其中： 式中：x1 样品中伏马毒素b1、b2的含量，g/kg； 试样液中伏马毒素b1、b2的含量，g/l； 空白试验伏马毒素b1、b2的含量，mg/l；v 最终定容体积，ml；w 最终样液所含的试样质量，g；m 试样称取的质量，g；v1 样品提取液总体积，ml；v2 移取样品滤液的体积，ml；v3 用于稀释滤液的缓冲液体积，ml；v4