分子生物学研究方法和技术

1、分子生物学研究方法和技术,湖南省农业生物技术研究中心 詹 庆 才 电话：84691351 Email:,本人基本情况,1984年获湖南农学院农学学士学位。1987年获中国科学院遗传研究所理学硕士学位，专业:分子遗传。 1999年11月-200年11月 受国家科技部派遣，在日本农林水产省北海道国家农业研究中心博士后特别研究员；主要从事基因定位和功能基因的筛选。 年：主要从事水稻细胞质雄性不育机理研究；水稻分子育种技术研究。 4：主要从事杂交水稻种子纯度快速鉴定技术研究；水稻品种指纹研究；基因定位和分子育种技术研究。,1、分子生物学的发展历程 1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。1943年，

2、证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery） 1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）基础研究的创新，与推动人类文明的进步。（以上被称为理论上的三大发现）,1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖） 1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶 长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。 1

3、973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用 基础研究向应用研究的拓展。 （以上被称为生物工程技术的的三大发明）,3个事例： （1）1976年，重组DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年获诺贝尔化学奖）勇敢的科学精神。 （2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量效率、成本、质量、竞争。 （3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年后来居上。,人类对生命现象的认识,20世纪 个体 染色体 基因 DNA SNP 生物与非生物间的界限消失了！ 21世纪 基因克隆，拼结

4、组装植物、动物、婴儿！,数、理、化相关学科,生物学实验技术,渗透 交叉,近代生物学,个性,共性,宏观生物学 （生态学为核心）,微观生物学 （分子生物学为核心）,细胞水平,分子水平,结构生物学，发育生物学，神经生物学等新兴学科发展,生物多样性 研究,资源保护与 利用,人类生态环境的保护 工农业生产持续发展,现代生物学的发展,分子生物学,分子生物学的延伸,2 分 子 生物 学 的 概 念,2.1 分子生物学的定义 2.2 分子生物学的三大原则 2.3 分子生物学研究的三大主要领域 2.4 分子生物学发展的三大支撑学科,2.1 分子生物学的定义,Molecular biology is the st

5、udy of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。,分子生物学与生物化学之间的关系与区别,分子生物学研究生物大分子的结构、功能及信息传递过程，从分子水平研究生命现象。,

6、生物化学生物体内的化学运动，包括化学组成、变化、结构与功能，生物分子间的物质与能量转换过程。,分子生物学生物化学, 构成生物大分子的单体是相同的, 生物遗传信息的表达的中心法则相同,高级结构,生物大分子之间的互作,2.2 分子生物学的三大原则,共同的核酸语言 共同的蛋白质, 生物大分子单体的排列（核苷酸，氨基酸）,结 构 生 物 学,基因分子生物学,生物技术理论 论与应用,2.3 分子生物学研究的三大主要领域,狭义的分子生物学分子遗传学,2.4 分子生物学发展的三大支撑学科,1839-1847年 Matthias Schleiden 3）保持一定的离子强度; 4）减少物理因素对核酸降解的机械剪

7、切力.,（二）防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,1. DNA酶抑制剂,1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； 2） 阴离于型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制剂,RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高

8、温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。 2）容易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4）剧毒。,（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物

9、(Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分离提取核酸的主要步骤,（一）细胞的破碎 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆 3 超声波处理法 4 液氮研磨法 5 化学处理法(SDS、吐温80等） 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。,常用方法： 1. 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2. 加入SDS S

10、DS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；,3 . 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严

11、重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。,1. 核酸沉淀的盐类及浓度,2. 有机沉淀剂,（1）乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。,（2）异丙醇,优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,（3）聚乙二醇（PEG）,优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相

12、对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的温度和时间,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。,

13、(四）核酸的浓度测定,1. 紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,a吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。 b分光光度计先用一定量的水校正零点。 c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d计算浓度。 双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀

14、释倍数 50； RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数40。 e分析纯度。,A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,测定结果分析,B：测RNA 纯的RNA样品其OD260OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2

15、.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。,2. 溴乙锭荧光法测定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。 原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。,（五）核酸的保存,对

16、DNA保存： DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 对RNA 保存： RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。,总RNA提取,目 的 1了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如PCR、Northern blot等。 2了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。 3获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。

17、4获得某一特定组织或细胞全部RNA。 以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。,根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。 RNA主要由rRNA（占总量的80-85），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15）以及mRNA（占总量的1-5）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。,提取总RNA的方法有多种，比如： 1) 酚/SDS法 2）采用Trizol试剂盒或类似的方法，称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低

18、，质量不够纯净。 3）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。 4）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，洗去其它杂质，最后洗脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。,植物总RNA提取(酚/SDS法 ),材料,液氮 研磨缓冲液：0.18mol/LTris 0.09mol/L LiCL 4.5mmol/L EDTA 1%（W/V）SDS 用HCL调PH至8.2,1mol/L Tris的配法：,在800 双蒸水中溶解121克Tris碱，用浓盐酸调PH值，混匀后加水至1升。,要获得所需PH值的1M Tris HCL，可通过

19、将一定数量的10M HCL和1升Tris碱混合，如下表所示:,0.5M EDTA的配制：,在700ML双蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH调PH8.0（1000ML 05M EDTA需加入20克NaOH），补加双蒸水至1升。,TLE缓冲液平衡酚 TLE溶液: 0.2mol/LTris 0.1mol/L LiCL 5mmol/L EDTA 用HCL调PH至8.2，用等体积的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次,氯仿：异戍醇（24：1） 8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC处理，焦碳酸二乙酯） 3MOL/L乙酸钠（DEPC处理），将408

20、克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸调PH5.2，补加水至1升95%乙醇DEPC处理水,试验步骤：,1、 用液氮冷却研钵，取15g低温冷冻的植物组织，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即转移到一个盛有150ML研磨缓冲液和50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml离心管中。 2、 加入50ml氯仿：异戍醇，于50加热20 min 。18000g, 4，离心20 min。,3、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml，混匀，再加入50ml氯仿：异戍醇，18000g, 4，离心20 min。,4、用 TLE缓冲液平衡酚

21、抽提水相，直至两面相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。 5、 吸取上清液，加1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，4沉淀过夜，然后15000g，4， 离心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液冲洗。 6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，于 4深沉RNA两小时以上。,7、 15000g，4， 离心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液冲洗，重溶于2ml双蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸钠溶液和5.5ml无水乙醇，-20沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。 8、18000g, 4，离心15min，

22、沉淀用1ml双蒸水溶解，取10 ul稀释至1ml测OD260和OD280,Trizol试剂盒方法,原 理 本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。,实验步骤 1取50毫克植物细嫩组织，加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。 222，静置5min。 3加入氯仿0.2ml，颠倒15s。 422，静置3min。 5离心：415000转/分15min。 6取上清液0.45ml。

23、 7加入0.45ml异丙醇，混匀。,822，静置10min。 9离心：415000转/分10min。 10弃上液。 11加入1ml 4 75%乙醇。 12离心：410000转/分5min。 13弃上液，真空干燥5min。 14用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70保存。 15紫外分光光度计测定RNA的含量：,取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水1ml，充分混匀。与蒸镏水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算： OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下： 样本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000 当OD值260/2801.8时，提示有

24、蛋白或酚的污染。,实验结果 得到比较纯净的植物组织总RNA。 分光光度计读数 260/280 值为 1.850.04。,植物RNA提取中的一些特殊方法,1、多酚类植物的RNA提取： 苹果、棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。用下述方法提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。 （1）1.5ml离心管用液N2冷冻后加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min.（2）4 12000rpm离心15min, 上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次（3）取600ul异丙醇,-20 沉淀20min.（4）

25、12000rpm离心10min（5）沉淀用70%乙醇洗（6）8000rpm 5min（7）沉淀晾干,溶于30ulDEPC水,2、 纤维组织： 心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，单位重量的组织RNA的含量就少，建议用尽可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纤维组织终RNA，由于纤维组织终RNA含量较少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中将组织彻底磨碎，同时适当减少溶解RNA的溶液体积。,3、 蛋白/脂肪含量高的组织：动物的脑和某些特殊的植物组织中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol来提取此类样品中的RNA。在该提取过

26、程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮状物，必须用氯仿再次对上清进行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的组织中RNA时，使用氯仿抽提后会分成油滴、水相（含RNA）、DNA中间层、有机相四层，应用移液管小心吸取水相液体，避免吸到油滴层和DNA层。,4、 核酸/RNase含量高的组织：脾、胸腺、胰脏等组织的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨组织，再快速匀浆。如果裂解液太粘稠（因为核酸含量高的缘故），酚/氯仿抽提不能有效分层，可以加入更多裂解液以解决此类问题。如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成则表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。,5、 植物组织和真菌组织：

27、植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，因此为了避免出现内源酶作用使 RNA降解的现象，一般选择在液氮条件下对植物或者真菌材料进行碾磨。如果降解问题不能解决，基本上是由于样品中的内含杂质导致。许多植物和真菌中的内含杂质如多糖、多酚等都会残留，因为这些杂质分子与RNA有一些相似性，可以与RNA同时沉淀或者吸附，因此在植物和真菌组织的RNA提取过程中，需要用一些特别的步骤或者特别的试剂（RNAplant）来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。,病毒RNA提取方法,异硫氰酸胍提取法:实验步骤：1、 取200ul样品数+阴性对照+阳性对照个1.5ml灭菌eppendorf管。2、 加600ul异硫氰酸胍，然

28、后加入对照和样品，再加200ul氯仿，颠倒混匀。3、 13000rpm离心15min。4、 在第3步离心快结束时，另取同样多eppendorf管，加入400ul -20度预冷的异丙醇。,5、 取第3步离心的上清（一定不要吸取到中间白色层，第3步离心结束往外拿的时候，管子尽量不要倾斜）转移到第4步准备的管中，颠倒混匀。6、 13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体。7、 加600ul 75乙醇，颠倒数次以洗涤残存异丙醇。,8、 13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体。 9、 4000rpm离心10s，将管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干

29、，室温干燥23min（不可过分干燥，防止下一步RNA不溶解）。 10、 加入20ul DEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA。2000rpm离心5s，冰上保存备用（最好2小时内使用，以免RNA降解）。,RNA提取注意事项,一些RNA提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。1、 在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。,2、 有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸

30、水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到5060，并将反应时间缩短到1525min，但酶用量必须提高1020倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。,3、 许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。,4、 许多生物材料在提取

31、核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。,5、 在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。6、 在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。,7、 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。 8、 在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，70下30min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。,9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，