2013临床PCR检测技术-实习生讲课

1、临床pcr技术,kary b. mullisusa, for his invention of the polymerase chain reaction (pcr) method,1930年提出了两种核酸dna和rna的概念,1953年watson和crick提出了dna双螺旋结构及其半保留复制模型。,一、pcr概述,一、pcr概述,（一）pcr概念 pcr （polymerase chain reaction)是一种在体外通过重复dna合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。 特点 高灵敏度 高特异性 体外进行 快捷,pcr的概念,核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的taq酶，使扩增反应不需

2、要每一个循环加一次dna聚合酶，从而实现了自动化。 应用领域迅速扩大，pcr技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。,pcr概述2000至2013年发表论文1280748篇,一、pcr概述,（二）原理 双链dna 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （dna合成）,不断重复,二、实验步骤,（一）核酸提取 1.dna提取,12000g离心5min,模板,二、实验步骤,2.rna提取,8000g离心1min,rna模板,8000g离心1min,逆转录 为cdna,重复洗2次,50ul血清,3、细胞或组织,模板,加样扩增,杂交显色,（二）扩增,hbv引物(168bp)

3、： 上游：5-gaagtgtgacgttgacatcc 下游：5-acagagtacttgcgctcagg 扩增体系：（50l体系） 10*buffer -5l dntp -1l mgcl2 -3l primer f -2l primer r -2l dna -2l taq酶 -1l h2o -34l,反应程序 预变性 94c 3min 循环 延伸 72c 5min。 注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板,30循环,（三）结果判读,（四）pcr的常见问题及处理措施,常见问题 污染：表现为阴性对照同样出现目的条带或阴性对照出现s形曲线。 污染的来源： 来自其他测试样品的dna 来自试验材料

4、如重组克隆的dna外源dna污染 来自同一靶序列前一次pcr的扩增产物。,（三）pcr的常见问题及处理措施,如何减少污染 实验室分区,酶法控制 尿嘧啶dna糖基化酶（ung) 短于100bp的pcr产物不能用ung完全消除污染。 紫外线表面照射 消除试剂、加样头中的dna污染。 对短pcr产物效果不好 以预防污染为主 良好的实验室操作,三、荧光定量pcr,（一）荧光pcr定量的概念,以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对pcr起始模板量的定量。,（二）荧光定量pcr原理,染料染色 sybr green i 溴乙锭(ethidium bromide) 探针标记 taqm

5、antm 分子信标(molecular beacons),taqman探针,（三）定量pcr的数学原理,pcr 理 论 方 程,n = n0 x (1+e)n,n:扩增数量 n0:起始模板数量 e：扩增效率 n:循环数,指数期pcr定量方程才有效,pcr曲线,线性图谱,半对数图谱,起点定量与终点定量,起点定量,终点定量,“加进不同拷贝的膜板”,同一个样品重复96次,起点定量的优势,终点产物数量： 误差太大,拐点产物数量：重现性好,起始dna量，更具意义 重现性好，误差小,起点定量的关键：ct值,ct值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过 阈值线)时的循环次数,ct值,半对数图谱,ct值,线性图

6、谱,ct 起始dna浓度,当循环次数n=ct值时：,rt = rb + x0 (1+ e)ct rs lg (rt - rb) = lg x0 + ct lg (1+ e) + lg rs ct lg (1+ e) = - lg x0 + lg (rt - rb) lg rs,即 ct = - k lg x0 + b （线性方程）,rn = rb + x0 (1+ e)n rs,ct值 - x0 作图,ct,x0,ct = - k logx0 + b,四、pcr检测的临床应用,（一）标本采集要求,（二）结果分析、报告及解释 1.定性pcr与定量pcr的比较 2.定量pcr测定的临床意义 3.定

7、性pcr测定的临床意义 4.定性和定量测定的结果报告及解释,1.定性pcr与定量pcr的比较,琼脂糖凝胶电泳,定量pcr扩增曲线图,2.定量pcr的临床意义,对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如hbv,hiv） 对治疗过程进行药物疗效监测 用于基因表达方面的研究,某患者hbv-dna的pcr结果动态图,3、定性测定的临床应用 诊断 用于筛检 耐药突变检测 病毒基因型检测,gg ag gg ag aa aa,4.定性和定量测定的结果报告及解释,（1）定性 阴性 阳性 （2）定量(以我科参考值为例) hbv-dna100 iu/ml(不同项目数值不同) 大于参考值，在检测范围之内，是多少报多少。,大于1