基因克隆及常见问题(1).ppt

1、内容概要,DNA克隆技术简介 DNA克隆常见的问题与对应策略,克隆实验的步骤,连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）,TA克隆 应用最广的非定向克隆方法。PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突出的T载体直接连接。方法简便，不需酶切，对引物设计也没有要求。,酶切连接克隆 PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过程本身也相当地费时费力。,DNA 克隆的几大要素,目的DNA片段,克隆载体,连接酶,感受态细胞,Taq、HotStart Taq DNA 聚合酶扩增产物为粘

2、末端，可直接进行TA克隆 pfu DNA 聚合酶扩增的产物为平末端，不能直接TA克隆，可加A处理或平末端连接 Taq Plus、Long Taq、Taq Platinum DNA聚合酶产物为部分加A，可直接用于TA克隆，但克隆效率比Taq酶低，建议加A处理,不同DNA聚合酶的PCR产物,PCR特异性好单一条带： DNA产物纯化试剂盒 超薄DNA产物纯化试剂盒 普通DNA产物纯化试剂盒 大量DNA产物纯化试剂盒 寡核苷酸DNA产物纯化试剂盒 96 DNA产物纯化试剂盒,PCR特异性不好多种条带：凝胶回收试剂盒 超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 大量琼脂糖凝胶DNA回

3、收试剂盒 聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒,目的DNA片段纯化,多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可能会影响后续连接反应，建议纯化。,所用洗脱液量对回收效率的影响,DNA纯化常见问题及对策,凝胶回收无产物或者回收率低,回收DNA质量不好,DNA纯化常见问题及对策,凝胶无回收产物或回收率低,电泳缓冲液老化，PH值升高 起始量少 PW未去除干净 使用去离子水进行洗脱 洗脱缓冲液用量过少,使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳 增加回收起始量 空甩2分钟或于50度温箱中放置5-10分 钟，充分去除PW 最好用试剂盒配备的EB进行洗脱 根据起始量使用合适体积的洗脱液,回收DNA质量不好,洗脱产物含有乙醇残

4、留,洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50烤箱中 510分钟，彻底去除漂洗液。,DNA纯化常见问题及对策,DNA 克隆的几大要素,目的DNA片段,克隆载体,连接酶,感受态细胞,载体3端的T与PCR产物3端的A互补连接，同时3突出端可防止载体自身环化，大大提高PCR产物的连接和克隆效率。 二者区别：多克隆区域的酶切位点不同,普通克隆T载体,分光光度法 受缓冲体系、样品稀释度、核酸二级结构、仪器本身等影响 DNAmarker定量法 EB分子插入DNA分子碱基间 50ngDNA即可显现清晰条带 定量方便直观,载体与片段的摩尔比1:

5、3-1:8,DNA 克隆的几大要素,目的DNA片段,克隆载体,连接酶,感受态细胞,T4 DNA连接酶,作用机理 催化相邻DNA链的5-P末端和3-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。 本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 反应条件 4 或16过夜 对应载体 pBS-T、pGM-T,连接体系,DNA 克隆的几大要素,目的DNA片段,克隆载体,连接酶,感受态细胞,感受态细胞,感受态细胞的种类：化学转化、电转化 感受态效率的测定 保存：-70冻存，避免反复冻融 常用于制备感受态的 E.coli 宿主菌,TIANGEN感受态细胞,Top10：转化效率高达108，适用于高效DNA克隆和质粒扩增 DH5a ：转化效率高达108，适用于高效DNA克隆和质粒扩增 BL21 ( DE3)：适合含T7启动子的载体中目的基因的表达 BL21 ( DE3) pLysS：适合毒性蛋白和非毒性蛋白的表达,TA克隆-转化,重组子的鉴定方法,内容概要,DNA克隆技术简介