法医DNA提取方法.ppt

1、,法医DNA提取方法,一、血液DNA的提取,Chelex-100法 酚/氯仿/异戊醇法 盐析法 磁珠法 硅珠法 FTA技术,Chelex-100法：,原理： Chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物，对多价金属离子有螯合作用，可防止DNA在煮沸加热前被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失，又可削除扩增中的一些抑制因素。,Chelex-100法：,优点：快速、方便，且仅在一个管内进行， 减少污染 缺点：DNA提取的浓度小，对检材条件要求较高，对被泥土、石灰粉、染料污染的检材效果不佳，常导致扩增效率下降或失败。,Chelex-10

2、0法：,所取全血与DNA含量之间的关系： 全血（ul） 理论DNA 产量（ug） 1 0.040.06 10 0.20.4 100 24 200 46 400 810,Chelex-100法：,注意事项： A核膜和其它试剂一起保留下来了，DNA纯度比有机溶剂提取法低； Bchelex-100法将DNA双螺旋打开，不能用像EB染料插入方法进行定量，只能用杂交方法定量； C由于沸水浴8min和快速振荡使DNA片段受到损害而断裂，对于大于500bp的片段扩增成功率低。 Dchelex-100在配置数小时后螯合能力就有下降趋势，将会导致提取的DNA溶液中有各种金属离子或抑制剂，对PCR反应可能有影响。

3、,酚/氯仿/异戊醇法,原理： 通过酚-氯仿混合物萃取 DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留 DNA 于水相溶液 中。 优点： 适用所有生物检材，提取 DNA 分子结 构完整，特别适合 RFLP、测序等需要大分子 DNA分析技术。,酚/氯仿/异戊醇法,缺点：操作步骤复杂，需要多次更换离心管，容易交叉污染； 注意事项： a. 操作中注意避免交叉污染； b. DNA得率较低，不适合微量DNA检材； c. 操作的误差所可能残留的成分可能抑制PCR反应，各种成分对PCR的抑制作用如下：,几种盐类对PCR的抑制浓度：,盐析法：,原理：利用6M的NaCl或醋酸钠沉淀蛋白质代替有机酚-氯仿抽提步骤去除蛋白质

4、，其他过程同有机溶剂提取法。 优点：操作简单，步骤少，不使用有毒害的化学试剂酚和氯仿 缺点：得到的DNA盐浓度较高，对下游的PCR反应影响较大,.磁珠法 ：,原理： 利用磁性硅胶吸附白细胞，用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。,磁珠法：,优点： 不需要离心，操作简单； 在同一个反应管内提取，没有样品的损失，更适合于自动化提取； 与chelex-100提取法相比，磁珠法回收率高，即使是0.5l血仍能得到DNA分型而用chelex-100提取同样量的血D

5、NA有时不能得到分型。,硅珠法：,原理： 在高浓度的硫氰酸胍的存在下，DNA被二氧化硅特异性的吸附，被吸附的DNA在没有硫氰酸胍存在下，DNA又从二氧化硅释放出来，硫氰酸胍是高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA分离，在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质等不溶物除去，吸附后的漂洗可将溶液中的PCR抑制物除去。,硅珠法：,优点： 提取的DNA比较纯，回收率高，可以从0.5l的血液中提取到足以进行PCR反应的DNA。,FTA技术,FTA技术的核心是一种专利化合物，FTA卡片预先被此种化合物浸透，当血液与FTA卡接触后，细胞膜被裂解，蛋白质发生变性，DNA分子则被捕获并与载体牢固结合，而且FTA

6、卡片上的DNA可在室温下长时间稳定保存，FTA卡可保护其上的DNA免受核酸酶、氧化作用、紫外线、细菌和真菌的影响，生物检材中可能存在的病原体与FTA卡接触后也将失活。 保存的DNA可以方便快捷的进行纯化和洗脱。,FTA技术,注意事项： 直接使用固定在FTA载体上的全血DNA进行STR复合扩增，可以得到稳定的分型结果，但是相比用洗脱下来的DNA溶液，分型图谱不是很理想，同颜色各基因座的峰均衡性不算很好，峰高差异比较大，基线不够平。,二、血痕DNA提取,chelex-100法 酚-氯仿法 碱裂解法 改良方法 采用磁珠法手工批量提取PCR模板DNA（苏勇，江苏省公安厅物证鉴定中心）,Chelex-1

7、00法：,注意事项： 对于大量血痕（如血纱布），剪取约11cm 2 大小，不可过多，否则会抑制PCR反应。如果血痕属微量血痕，可直接用进样器吸取20-40ul灭菌去离子水，然后在血痕处反 复吹打，将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中。,2.对部分陈旧、或污染有多量泥沙、载体吸附力强或色素深的血痕检材，经一次chelex-100 的处理，仍不能扩增成功，这可能是由于以下几个原因： 血痕过于陈旧，血色素无法溶解下来，使血色素对扩增的抑制增强，导致扩增失败。 血痕受泥沙或载体色素的影响，使扩增受到抑制。 血痕载体吸附力强，导致DNA提取率降低。 血痕量太少，超出检验灵敏度。,针对以上几种影响因素，进行

8、一些改良处理：,对难于溶解的陈旧血痕，可加入1/10体积的10SDS，促进血色素的溶解，易于洗涤， 减少血色素对扩增的抑制。 对受泥沙或载体色素影响的血痕，可对首次DNA提取液进行二次提取，使模板被稀 释，减少载体的干扰，进一步去除模板中的扩增抑制物。 对载体吸附力强的血痕，可增加浸泡时间，同时也可结合上述方法。 对于量少而受污染的血痕，经上述处理后，再经超滤柱过柱浓缩，使模板DNA浓度 达到可检测范围。在检案过程中，检材经常是受多种因素的影响，因此可综合利用上述几种处理方法。,碱裂解法：,原理： 在强碱作用下，使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅速发生电离，从而快

9、速破坏蛋白质的一级结构。正因为强碱对蛋白质有 强烈的变性乃至裂解作用，所以，检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞 膜及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。此时，DNA的一级结构是相对完整的。,碱裂解法,优点： 耗时少，一般只需5 min； 提取DNA所耗检材少，灵敏度高； 所需试剂、仪器成本极低； 由于所用试剂中含有强碱，可以有效抑止Tag酶抑制剂的作用，所以对于相同的位点， 可以取得跟chelex-100相似的扩增效果。,碱裂解法,注意事项： 血痕要求在7580 之间保温5 min，若检材为陈旧性，尚应适当延长保温时间510min。,一种改良方法,将 chelex-100 法或碱性裂解法处理的血痕，用等体积的饱和酚-氯仿（1