变性蛋白的复性.ppt

1、第十一节 变性蛋白的复性,以大肠杆菌作为表达系统生产基因工程药物时,药物蛋白通常会形成无活性的蛋白聚体即包含体,它们的一级结构即氨基酸序列是正确的,但空间结构错误,没有生物学活性。需要一个复性过程才能得到生物活性蛋白。,包含体是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,包含体的优势： 1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势； 2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解； 3、对宿主毒性小：生

2、产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。,一、包含体形成的原因,主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形成。 重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。,包含体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，无定形，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。,二、包含体的分离和溶解,1、包含体的分离 收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使用变性剂

3、洗涤沉淀。 2、包含体的溶解 打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽链伸展。,溶解采用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，SDS，各种溶解方法都各有利弊。 含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。 加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。,三、包含体蛋白复性方法,几个 要求： 活性蛋白的回收率高 正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品 复性过程耗时少,1、稀释、透析复性法,蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。降低蛋白浓度可以减少

4、中间体形成提高复性率。,方法：在复性前用使用稀释、透析、过滤及凝胶过滤除去变性剂、还原剂。将变性蛋白连续缓慢的加入到复性缓冲液中。复性中通过透析逐渐减少透析缓冲液中的变性剂浓度。,复性缓冲液的pH要远离等电点；离子强度不易过高，10-50mmol/L，离子强度太高蛋白质易发生沉淀，也不利于离子交换层析的分离；复性液温度不易过高在4-10较合适，对于耐热蛋白也可以室温复性；复性时间，以天然表达的重组蛋白复性应在6hr以上。,蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，

5、使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。,分子量，等电点，二硫键。稀释复性方案如下：8M尿素变性，37度2h。 50mM Tris pH8.0 ，50mM Nacl，1mM EDTA ，1% Gly，10%甘油复性，1/100稀释复性，1%蛋白，室温过夜，16h。DEAE柱富集，新胶上柱后，用0.5M NaoH，8M urea，洗脱蛋白。,2、含有二硫键的蛋白的复性,复性时涉及正确二硫键（分子内或者分子间）的重建。 空气氧化法加入氧化剂-还原转换试剂 加入氧化型谷胱甘肽使用还原剂保护巯基加入二硫苏糖醇。,3、封闭蛋白的疏水簇促进复性,对蛋白质结构和序列的分析，确定出在蛋白中可能

6、引起分子间相互作用的疏水簇。用特异性结合疏水簇的单克隆抗体来封闭疏水簇，减少分子间结合引起的聚集。,4、凝胶过滤层析复性,层析介质的隔离作用，降低了蛋白之间相互作用产生的聚集，使复性浓度、复性率得到很大的提高。,5、小分子添加剂促进复性,可以抑制蛋白聚集体的产生，可以稳定蛋白的活性状态，降低非正确折叠蛋白的稳定性等作用。 6、分子伴侣或折叠酶促进的复性 7、人工分子伴侣促进的复性,分子量，等电点，二硫键, 疏水结构 1PBS或生理盐水洗涤菌体，BufferA重悬菌体，超声波破碎至清亮。 4 ，10000rpm离心10min，弃上清。 用PBS或生理盐水洗涤沉淀2-3次。 往沉淀中加Buffer

7、A及20的SKL（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置30min至h。 4，10000rpm离心10min，取上清。,加20PEG4000至终浓度为0.2，加50mM的氧化型谷胱甘肽至终浓度为mM,加100mM的还原型谷胱甘肽至终浓度为mM,静置30min至h（亦可复性过夜）。 . 以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出-20保存备用。 8 .检验复性是否成功。 BufferA配方： Tris-base50mM,EDTA0.5mM,NaCl50mM, 甘油5% ,DTT5mM,第十二节 基因工程药物的质量控制,是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有

8、复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。,宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。,一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点,1、产品安全性评价 2、产品本身的结构 3、严格控制条件,二、生物材料的质量控制,原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。包括对目的基因、表达载体、宿主细胞的检查。,根据质量控制要求应了解以下特性: 目的基因：明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切

9、图谱和核苷酸序列予以确证；,表达载体：应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物; 宿主细胞：应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性,须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性； 提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。,三、培养过程的质量控制,在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微

10、生物污染。,生产用细胞库：生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。 原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。,对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；,培养过程：在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品

11、。 培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。,四、纯化过程的质量控制,产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。,五、目标产品的质量控制,基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。,重组蛋白质药

12、物产品常用的鉴别方法 电泳方法： SDS-PAGE,等电聚焦， 免疫电泳 免疫学方法：RIA, RID，ELISA,Immunoblotting 受体结合实验（ Receptor Binding） 各种高效液相分析法（HPLC） 肽图分析法 Edman N 末端序列分析法 圆二色谱（CD） NMR,1.生物活性测定：需要动物体内实验和通过细胞培养进行体外效价测定。 体内生物学活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型，体外生物活性测定有细胞计数法等。 重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。,效价测定必须采用国际上通用的方法，测定结果须用国际或国家标准品

13、进行校正，以国际单位表示或折算成国际单位标准。 蛋白的比活性是每毫克蛋白质的生物学活性，是重组蛋白质的一项重要指标，不仅是含量指标，也是纯度指标。,2.理化性质鉴定 肽图分析：用酶法和化学方法降解目的蛋白，对生成的肽段进行分离分析，是检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。灵敏、高效。高效液相色谱和毛细管电泳。氨基酸成分分析：小于50个氨基酸分析结果较可靠。部分氨基酸序列分析：氨基端15个氨基酸。,重组蛋白质的浓度测定：凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法。 相对分子量测定：凝胶过滤法（完整）和SDS-PAGE法（亚基）。,杂质检验：包括蛋白质和非蛋白质杂质。 蛋白类

14、：宿主细胞蛋白，采用免疫方法和电泳相结合； 非蛋白类：病毒、细菌等微生物、热源质、内毒素、致敏原及DNA。利用微生物学方法检测无菌。热源质检测用家兔注射。,稳定性考察：是评价药品有效性和安全性的重要指标，也是确定药品储藏条件和使用期限的主要依据。对温度、氧化、光照、离子浓度和机械剪切等环境因素都很敏感。产品一致性保证：生产周期长，影响因素多，必须对每一步都进行严格的控制。,基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法 杂质和污染物 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热源法 宿主细胞蛋白 免疫分析、SD-PAGE、CE 其他蛋白杂质（如培养基） SDS-PAGE、HPLC、CE、免疫分析 残余D

15、NA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 蛋白变异 肽谱、HPLC、IEF、CE 甲酰基甲硫氨酸 肽谱、HPLC、IEF、CE 甲硫氨酸氧化 肽谱、氨基酸分析、HPLC、质谱、Edman分析 产物变性或聚合脱氨基 SDS-PAGE、凝胶排阻色谱、IEF、HPLC、CE Edman分析、CE 单克隆抗体（亲和配基脱落） SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、CE、Edman分析、质谱 微生物（细菌、酵母、真菌） 微生物学检查 支原体 微生物学检查 病 毒 微生物学检查,六、产品的保存,防止变性，降解，保护其活性中心。 液态保存 （1）低温保存：液态蛋白质样品在-10到-20C以下冰冻保存。 （2）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH 范围内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的pH 范围内。, 液态保存 （3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。 （4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。,2、固态保存 一般蛋