非小细胞肺癌文献一篇.ppt

1、1,Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Methods for Measuring Dipeptide Abundance in Non-Small Cell Lung Cancer,褚晓芳,使用液相色谱-质谱技术分析 非小细胞肺癌患者组织中二肽丰度的变化,主要内容,肺癌简介 实验流程 样品处理 LC/MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,主要内容,实验结果 肺癌相关二肽数据库产生 肺癌组织中二肽的识别 MS/MS二肽谱图 不同分析条件下二肽的识别 肺癌组织中二肽的靶标分析 结论验证 研究意义及不足,肺癌简介,在美国，肺癌死亡率

2、在所有癌症中最高，2012年共有165000死于肺癌。在全世界范围内，估计肺癌影响超过100万人。肺癌中80%是非小细胞肺癌 目前，肺癌早期及进展阶段仍没有灵敏度高的诊断手段 肺癌相关的代谢组学研究较少,肺癌相关研究,肺癌早期的代谢组学研究表明在肿瘤样本中有许多代谢物发生表达的改变 在不同化疗耐药性的肺癌细胞系中，胆碱、脂肪、乳酸、甘氨酸水平有明显的改变 在埃罗替尼治疗或进行切除手术的患者中，同侧细支气管肺泡癌发生病变 在肺癌患者血清和组织样本的混合物中，有48种代谢物在组织和肺癌不同进展阶段有明显改变,二肽对真核生物的作用,二肽在蛋白质营养、增长及发展中其重要作用 二肽水平通过肽转运体中的膜

3、蛋白调节 肽转运体广泛存在于大脑、胰腺、肠、肾脏等器官中,主要内容,实验流程 样品处理 LC/MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,样品处理,Testing set: 9名确诊为肺癌恶性腺瘤的男性 样本: 有代表性的肺癌组织切片 与肿瘤组织相邻的正常组织切片 距原发肿瘤3cm处的正常组织切片,样品处理,Validation set 10名确诊为肺癌恶性腺瘤的男性 样本: 有代表性的肺癌组织切片 距原发肿瘤3cm处的正常组织切片,样品处理,Validation set 6名确诊为肝癌的患者 目的: 证明在非小细胞肺癌患者中找到的代谢物标 志物具有特异性 所有样品在分离后快速

4、冷冻30-60min，处理前在-80保存,样品处理,组织提取 将分离的组织称重后用不锈钢珠同质化，频率为20次/s，持续30s 加入标准溶剂混合物重复4次同质化过程 用蒸汽离心蒸发浓缩器干燥氯仿-甲醇-水层中的极性代谢物 将干燥后的样品复溶于水,样品处理,衍生化：50L极性代谢提取物+25 L0.1M的四硼酸钠缓冲液+50 L 20mM丹磺酰氯(乙腈为溶剂)，涡旋混匀 丹酰衍生化目的: 提高代谢物检测敏感性10-1000倍 提高极性代谢物在液相色谱柱上的保留和分离 室温孵育30min，加入50 L 0.5%甲酸停止反应 将反应混合液上层清液转移至自动采样瓶,主要内容,实验流程 样品处理 LC/

5、MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,LS/MS工作原理： 通过液相色谱分离化合物(主要是沸点高、极性强、热稳定性差的化合物)，再通过电喷雾电离产生样品离子，进入质谱仪后按质荷比分离，然后测定各种离子谱峰的强度而实现分析目的。,梯度洗脱装置: 利用两种或两种以上溶剂，按照一定的时间顺序连续或阶段改变溶剂比例，从而改变流动相的极性、离子强度和PH值，使样品的各组分在最佳容量因子值范围内流出色谱柱，改善分离效果,质谱解析一般步骤: 核对获得的谱图，扣除本底等因素引起的失真 尽可能判断分子离子，即确定分子质量;谱图中往往有很多碎片离子，这些碎片离子是由准分子离子裂解产生,假设和

6、排列可能的结构归属，高质量离子显示的M-1，M-15，M-18即表示失去H、CH3、H2O 推出可能的分子结构，以标准谱图对比，确定分子结构,LC/MS分析,仪器：安捷伦6520系列四极杆飞行时间串联质谱仪(带有安捷伦1290超高效液相色谱系统) 方法A： Zorbax C18液相分析柱 流动相流动速率5 L /min 洗脱液B:5%-95%浓度梯度 洗脱时间:30min，95%B时维持5min,LC/MS分析,溶剂A:HPLC水+0.1%水 溶剂B:LC/MS级乙腈+0.1%甲酸 毛细管温度:325 m/z10-1000之间进行全谱扫描 常用固定相:硅胶、氨基、二醇基等 常用流动相:水、乙腈

7、、异丙醇,LC/MS分析,方法B: Phenomenex Kinetex C18液相分析柱 流动速率0.5ml/min进行洗脱 洗脱液B:5%-95%浓度梯度,LC/MS分析,方法C: Kinetex 液相分析柱 流动速率0.5ml/min进行洗脱 洗脱液B:10%-95%浓度梯度,主要内容,实验流程 样品处理 LC/MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,MS/MS分析,仪器：安捷伦6520系列四极杆飞行时间串联质谱仪 靶向MS/MS分析: 保留时间:0.6min 离子碰撞能量:26V(质量大的分子:32V) 分离宽度:4m/z,为何在用LS/MS分析后，还要采用MS/M

8、S分析？ LS/MS谱图中样品的准分子离子峰丰度较高，碎片峰则少而弱，因此主要给出与样品的分子质量相关的信息，而很少给出与样品结构有关的信息，采用多级质谱MS/MS可以弥补这一缺陷。,主要内容,实验流程 样品处理 LC/MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,MS数据分析,非靶向数据分析:使用代谢组学分析软件提取保留时间一致的峰，用最小二乘法检测非靶向代谢物的特征，比对特征分析数据库识别评估的结果。 靶向二肽数据分析:使用二肽数据库和特征分析数据库进行比对,MS数据分析,为什么要进行峰对齐？ 为了利用色谱图中所有可以识别的峰的信息，必须对谱图进行峰匹配，不同样本中同一代谢产

9、物在生成的数据矩阵中必须由同一变量来表示，这样各个样本间的数据才可以比较。 对数据的要求：有相同数目的变量描述每个变量在样本中均出现所有样本中的变量代表的意义相同,主要内容,实验流程 样品处理 LC/MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,质量控制,进样前后分析经过衍生化的26种氨基酸标准混合物 目的: 保证衍生化作用有效进行 检验仪器性能状态的良好 保证能够获得连续的保留时间,主要内容,实验流程 样品处理 LC/MS分析 MS/MS分析 MS数据分析 质量控制 统计分析,统计分析,非参数秩和检验:评估肿瘤组织与两种正常组织中检测的二肽水平有无明显变化 结果:没有相关的二肽

10、有显著性差别 二项分布:在检测的334种二肽中有105种有统计学意义 因3个样本来自同一个体，故需分析样本大小对代谢物检测结果的影响,主要内容,实验结果 肺癌相关二肽数据库产生 肺癌组织中二肽的识别 MS/MS二肽谱图 不同分析条件下二肽的识别 肺癌组织中二肽的靶标分析 结论验证 研究意义及不足,肺癌相关二肽数据库,标准品二肽合成:基于组合合成法的阵列及包含组氨酸的二肽，不能合成的二肽通过Aanspec Int公司获得 混合物配置:将7-30毫微升具有相同C羧基端的18种二肽混合并用50%乙腈和水稀释成10 M，丹酰衍生化后，采用LC方法B及MS全谱扫描,肺癌相关二肽数据库,氨基酸是生物样本中

11、唯一分析物，故用氨基酸作为标准品 氨基酸保留时间的多项对齐是对齐二肽保留时间最好的方法,肺癌组织中二肽的识别,361种二肽中只有161种有独特的化学分子式，只有17种是单一的异构体(AA) 同分异构体二肽的识别需要仔细比较其滞留特性 合并肿瘤样本再分析得到279种二肽，其中234种二肽的质量精度5ppm，45种10ppm，将279种二肽保留时间与数据库比对，大部分二肽保留时间在0.1min内，但有精氨酸的二肽标准品和样品有明显不同,MS/MS二肽谱图,丹酰化二肽的MS/MS谱图通常不提供信息，而主要以丹酰离子为主 由丹酰分离出来的C12H12N阳离子在大部分丹酰化二肽谱图中产生基峰，m/z为1

12、70.0964 95%测量值与真实值相比降低(精度误差小于13ppm) 根据测量值得到的化学分子式精度误差都在13ppm以内,MS/MS二肽谱图,MS/MS二肽谱图,其他丹酰特征的离子还包括: m/z 234.059 (C12H12NSO2)在单一带电离子中普遍存在且变异较大； m/z 252.069 (C12H14NSO3) 在含氧二肽中普遍存在； m/z 186.092 (C12H12NO)离子也很普遍,MS/MS二肽谱图,丹酰化二肽分裂处(经典离子),MS/MS二肽谱图,丹酰化二肽分裂特征碎片,MS/MS二肽谱图,MS/MS二肽谱图其他明显特征： 由氨基酸I/L/V/A组成的二肽在位1或

13、位2有经典的I离子 色氨酸的I离子会发生中性分子的丧失，产生m/z144和130 的特征性碎片 二肽通过中性丢失(焦谷氨酸盐)使c离子增加 带有氨基酸R、K、H的二肽有复杂的特征 二肽XR、RX使m/z为156/157碎片增多,MS/MS二肽谱图,赖氨酸二肽经常带双电荷，m/z317碎片显著，还有m/z84经典碎片 组氨酸二肽也经常带双电荷，I1和I2碎片离子较多 HX双电荷二肽与NX、MX有相同的m/z261的碎片离子 蛋氨酸二肽在m/z337发生多次分裂，产生不同碎片离子,不同分析条件下二肽的识别,氨基酸作为内标可以使来自不同实验室的代谢组数据具有可比性 本地散点平滑估计(LOESS)是最

14、好的校准二肽保留时间的方法,肺癌组织中二肽的靶标分析,采用最小二乘法比较肿瘤组织与正常组织中丰度变化明显的二肽 有257种二肽至少在一种组织中被检测到，其中253种在肿瘤组织中检测到 在肿瘤组织中检测到90种二肽丰度与正常组织相比有明显的增加(倍数2,P0.05) 成倍增加的倍数在2.1-23.1不等，其中有58种5倍，11种10倍,结论验证,验证队列：10组配对的肿瘤组织-正常组织 (没有分析与癌组织相邻的正常组织) 单侧秩和检验分析结果： 145种二肽至少在一种组织中检测到，其中22种二肽在肿瘤组织中明显升高(P=810-10),结论验证,其他分析： 邻近正常组织中179种二肽被检测到，但只有3种与相应的