Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化

1、01 血清球蛋白的分离与纯化【目的要求】1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。2.熟悉盐析、离心、层析、电泳、比色等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。4.学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案、技术路线和质量监控和保证措施。【实验原理】不同蛋白质的理化性质和生物学性质各有不同，利用这些不同便可获得分离纯化。血清蛋白有300多种,可粗略分成清、球蛋白两大类，球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡聚糖凝胶G25（Sephadex25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换柱，便可直接

2、从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出球蛋白，其反应机理如下：被柱层析交换结合的球蛋白和球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。纯化前后的球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。【实验准备】一、器材1.离心机2.层析柱(直径约1-1.2cm,长约30cm)3.电泳仪二、试剂1.饱和(NH4)2SO4溶液 称固体(NH4)2SO4（分析纯）850g置于1,000ml蒸馏水中，在7080水中搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和(NH4)2SO4液。2.葡聚糖凝胶G25按每100ml凝胶床需干的葡聚糖凝胶G25 25g，置于锥形瓶中，

3、按每克干胶加入蒸馏水约30ml，轻轻摇匀并于沸水浴中加热1小时，或于室温浸泡24小时，搅拌后稍静置，倾去上清细粒，用蒸馏水漂洗。3.0.075mol/L pH6.3磷酸缓冲液(pH6.3 PBS)0.0175mol/L NaH2PO4液秤取NaH2PO4 2H2O 2.730g溶于100ml蒸馏水中，转入1000cc容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度即成。0.0175mol/L Na2HPO液秤取Na2HPO412H2O 6.269g，如配制即成。取液77.5ml、液22.5ml，混匀后即成0.075mol/L pH6.3的磷酸缓冲液。4.20%磺基水杨酸。5.Nesseler试剂6.血清醋酸纤维薄

4、膜电泳实验的全套仪器及试剂。7.DEAE（二乙氨基乙基）纤维素处理 按100ml柱床体积称取DEAE纤维素14g，每克加0.5mol HCl 15ml搅拌，放置30分钟（HCl处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质），加约10倍量的蒸馏水搅匀，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液，如此反复23次，沉淀30分钟，虹吸吸去上清或布氏漏斗抽滤，如此水洗至清液pH4为止。加等体积1mol NaOH，使最终浓度约为0.5mol NaOH，搅拌后，放置30分钟，以虹吸吸去上层液体，同上用蒸馏水反复洗至pH7为止，虹吸吸去上层液体，然后加入0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液使之平衡

5、，置4冰箱内保存备用。【实验操作】1.(NH4)2SO4盐析 取血清2.0ml，缓慢滴入饱和（NH4）2SO4溶液2.0ml，边加边搅，混匀后于室温中放置10分钟，然后3000转离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液1ml，使之溶解，作为纯化球蛋白用。2.凝胶层析脱盐葡聚糖糖凝胶G25层析柱的准备：取层析柱垂直夹于架上，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液，待底部凝胶沉积到12cm时，再打开出口，并用玻璃棒插入到凝胶床表面下，轻轻搅动，继续加入凝胶，待凝胶下沉至1015cm高（防止凝胶分层和柱内混有气泡，使表面平整并盖一尼龙布或塑

6、料片）。用0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液流洗平衡后，即可使用。上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面（注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进入凝胶床）。关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢加到凝胶床表面上（注意不要将凝胶粒冲起或破坏凝胶床表面的平整）。开下端出口，使样品进入凝胶床后再加少量的缓冲液，如此重复三次，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后可加入适量的缓冲液洗脱。加样开始后应立即收集洗脱液，流速约0.5ml/分钟，每2分钟收集一管。洗脱液中蛋白质与NH+4的检查：取比色皿2个（一个为黑色背底，另一个为白色），按洗脱液的管号顺序分别取1

7、滴，滴于比色皿中，前者各加20%磺基水杨酸2滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。于另一比色皿中各加入Nesseler试剂1滴，以观察NH+4出现的情况(若有棕黄色，即碘化双汞铵NH2Hg2I2生成，说明有NH+4的存在)。合并球蛋白含量高的各管，用DEAE纤维素阴离子交换柱纯化。纯化前后取样鉴定。3.DEAE纤维素阴离子交换层析 经处理再生后的EDAE纤维素，按上法装柱，用0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液平衡，将脱盐后的球蛋白溶液加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱，分部收集，检查洗脱蛋白质的分布情况（装柱、上样、洗脱、收集

8、及蛋白质检查等操作步骤有关注意事项同上）。【实验结果】一、纯度鉴定采用醋纤膜电泳法。样品三个：（1）血清。（2）葡聚糖凝胶G25脱盐球蛋白液。（3）DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的球蛋白液（由于此溶液浓度较低，应多次点样，每次点样时待干后再点，共约点1520l）。电泳及染色：方法同醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验，比较样品的电泳结果。二、定量检测1.用双缩脲法定量血清总蛋白，盐析出的球蛋白总量，计算A/G值。还可测定脱盐前后球蛋白总量，计算球蛋白盐析收得率，观察脱盐对球胆白收率究竟有无影响。2.用Lowry,s法定量DEAE柱各分部收集管中的球蛋白含量，制作球蛋白洗脱图，并讨论其意义。3.可

9、对两种定量方法做平行对照测定，讨论这两种方法适用价值【注意事项】1.勿使盐析中发生共沉。为此加饱和(NH4)2SO4时每滴不宜大，速度不宜快，边加边搅动。2.严格按柱层析的装柱、上样的技术要求，装好G-25柱，上好待脱盐的盐析球蛋白液；装好DEAE柱，上好待分离纯化球蛋白的脱盐球蛋白液。3.脱盐流速不宜过快，一般0.5ml/M为宜。4.pH6.3是DEAE离子交换层析柱从样品球蛋白中截留和球蛋白，放行球蛋白，致使球蛋白得以分离纯化的关键pH，必须调配准确。5.Nesseler试剂是检查球蛋白盐析液通过G-25柱的流出液中有没有NH4+，何时才有NH4+的试剂，事关脱盐效果。该试剂的酸碱度对检察的准确性和灵敏度甚为重要。为此，可用该试剂滴定20ml、 mol浓度的标准HCl，从其耗量（即滴定值）评价其酸碱度。具有最适酸碱度的Nesseler试剂，对20ml标准HCl的耗量在1111.5ml。若耗量超出11.5ml说明该试剂偏酸，显色偏浅，测试将出现假阴性；如消耗低于9.5ml，试剂偏碱，显色偏深，乃至出现红色沉淀，测试结果会出现假阳性。若遇上述情况可用无Na2CO3的10%的NaOH溶液或molHCl进行调试。6.应选择快速、灵敏定性检测方