2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定.ppt

1、上课前： 每组清洗一个50ml容量瓶 用蒸馏水润洗后备用 不用烘干,两水相系统中蛋白质 分配系数的测定,指导教师：龚小雁 张秀萍,了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。,一、实验目的和要求,本实验中：,二、实验原理,两水相系统： PEG/(NH4)2SO4,分配对象：糖化酶,蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝比色法,两水相分配： 在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。 分配系数K ： 当萃取达到平衡时，蛋白质在上下两相中的浓度之比，对于固定的相系统，K为常数。 K = C上/ C下 相比R ： 上下相体积比。 R = V上/ V下,二

2、、实验原理,二、实验原理,糖化酶： 生物大分子蛋白，-,-葡萄糖水解酶。 黑曲霉经发酵制得 。 广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，将淀粉转化为葡萄糖 。,考马斯亮蓝比色法： 常用的蛋白含量检测方法。 考马斯亮兰G-250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质结合后转为蓝色，595nm波长下有最大吸收值。低浓度范围内（0.011.0mg/ml），与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。,二、实验原理,试剂： PEG400、蒸馏水、(NH4)2SO4、糖化酶、考马斯亮蓝、牛血清蛋白等。 器材： 移液管、刻度离心管+盖子、台秤、离心机、试管、50ml容量瓶、恒温水浴锅、分光光度计+比色皿等。,三

3、、实验器材与试剂,（一）试剂配制（已配好） 考马斯亮蓝G-250溶液：精确称取50mg考马斯亮蓝，溶于10ml 95%乙醇中，并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。 牛血清蛋白溶液 （BSA）：精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120g/ml的牛血清蛋白原液。,四、操作方法,（二）蛋白质在两相中的分配,10ml刻度 离心试管,(NH4)2SO4 固体1.30克,PEG400 2.00克,糖化酶2.00ml,水,台秤,总重8.00g,振摇混和 (固体充分溶解),离心 3000转/分 5min

4、,求相比： R =V上/V下,求分配系数 ： K = C上/ C下,四、操作方法,平衡,（三）考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量 制作标准曲线：在试管中，按下表精确加样，反应检测。 两相中取样及蛋白测定： 上相液：吸取0.5ml，蒸馏水定容至50ml，取1ml稀释液于试管中，按下表反应检测。 下相液：吸取0.1ml于试管中，加入0.9ml水，按下表反应检测。,空白对照,绘制标准曲线： 标准曲线方程（线性回归）： 蛋白量：y=ax+b 上相：C上=(ax1+b)*100 ug/ml 下相：C下=(ax2+b)*10 ug/ml,分配系数的计算：,蛋白含量/g,分配系数 K = C上 / C下,操作注

5、意点,蛋白质分配： 称重时，按顺序加入物料，中间不要再去皮，最终控制累积总重8.00g。 橡皮塞不干净，用保鲜膜包裹下。 离心前试管必须要两两称重平衡。 取样： 不要取相界面附近的样品。 取下相样品液时，先用滴管将上相完全吸掉，并吸掉部分下相后，再取样。 避免将上相混入下相。 检测： 试管中加完物料后，要混和均匀。 保温结束后，立即放入冷水中，待测。 分光光度计空白参比管T模式调100%，A 模式调0 。,（一）预习 配制两水相萃取系统时，PEG400液体的加量能否改为量取相应的体积？说明理由。 试述使用台式离心机的操作顺序。 用比色法分析上下相蛋白质浓度时，如何精确吸出在同一离心试管中的上下两相？写出操作步骤。 （二）实验结果和讨论 将比色分析的操作过程及结果列成表格，作出标准曲线，线性回归。 计算上下相蛋白质浓度、分配系数K、相比R，计算两相中PEG和(NH4)2SO4的含量。 在配制两水相系统时，为什么必须充分混合？混合不充分会带来什么影响？,五、思考题,M：系统组成 T：平衡时上相组成 B：平衡时下相组成 TMB：系线 同一条系线上各点系统组成不同，但平衡后分成的两相组成相同