细胞工程基本技术

1、第三章、细胞工程基本技术,基本技术,实验室条件 无菌技术 显微技术 细胞观察与分析 细胞分离 细胞保存与复苏,实验室基本组成,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。,基本实验室,准备室： 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。 培养室： 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，

2、培养室应保持干燥和清洁。,辅助实验室,细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。 生化分析室： 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,实验室布局的基本要求,便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。,实验用品及主要设备,玻璃器皿 常用器械 细胞培养的主要设备,玻璃器皿,液体储存瓶 吸管 离心管 培养皿 培养瓶与培养板 其它器皿1,常用器械,解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球

3、、封口膜、酒精灯等,胞培养的主要设备,基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。 光温控制设备 ：时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备 ：光学研究显微镜、倒置显微镜等。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。,无菌技术,无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。 培养基 器皿材料 接种工具 操

4、作环境 培养室 工作台面 具体的灭菌方法有多种 污染检测与控制,玻璃器皿清洗,浸泡刷洗浸酸冲洗,无菌室,无菌操作室和无菌培养室 要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流,灭菌种类,物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌 化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢） 抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。 根据灭菌对象选择不同的灭菌方法,高温高压灭菌,原理：在121高温和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20分钟后，就可杀死一切微生

5、物的营养体及其孢子。 适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。,干热灭菌法,将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。 适用于玻璃器皿。,射线灭菌,紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到灭菌效果。,过滤灭菌,原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。 常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。 组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。,蒸灭菌,用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。 常用的方法是将甲醛和高锰酸钾

6、混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。,消毒液灭菌,依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。 70%酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等； 升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。,室内灭菌,2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟 定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸,试剂和器皿的灭菌,包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌 培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌,污染检测与控制,细菌：可采用抗生素预防 真菌：可采用抗真菌剂防治 支原体：可采用抗生素、加温处理（41

7、）、使用支原体特异性血清 病毒：脱毒 细胞交叉污染：严格操作规程,显微技术,显微观察技术： 显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。,细胞观察与分析,细胞计数与活力分析 细胞固定与染色观察 凋亡细胞观察 染色体分析,细胞计数与活力分析,采用血细胞计数法计数 活力分析： 台盼蓝染色法：死细胞着色 MTT ：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力,血球计数板,计数法,细胞固定与染色观察,细胞固定 甲醇-醋酸 FAA Carnoy 细胞染色 苏木精-伊红（H.E)染色法 Giemsa染色

8、法 Feulgen染色法 考马斯蓝染色法 免疫荧光法 免疫过氧化物酶染色法,凋亡细胞观察,形态观察: 生化分析: 锚定蛋白:检测凋亡早期 PI:检测晚期或死细胞 分子技术:梯形电泳图谱,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,FITC-AnnexinV染色,FITC-AnnexinV和PI染色,梯形电泳图谱,染色体分析,样品处理:秋水仙素 低渗处理 固定化 染色观察,细胞分离,细胞初步分离 差速离心分离法 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离,细胞保存与复苏,目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法 预保留细胞经消化分散

9、后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释 按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。 将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25 冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150- -190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化,思考题,植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？ 消毒灭菌种类有哪几类？ 使用高压锅的基本步骤是什么？ 用血球计数板进行计数时，细胞数/L=N*25/5*10*106*稀释倍数，N指什么？ 对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？ 简述细胞低温冷冻保存的方法,第三章、

10、细胞工程基本技术,基本技术,实验室条件 无菌技术 显微技术 细胞观察与分析 细胞分离 细胞保存与复苏,实验室条件,实验室基本组成 实验用品及主要设备,实验室基本组成,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。,基本实验室,准备室： 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。 培养室： 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要

11、能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。,辅助实验室,细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。 生化分析室： 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,实验室布局的基本要求,便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。,实验用品及主要设备,玻璃器皿 常用器械 细胞培养的主要设备,玻璃器皿,液体储存瓶 吸管 离心管 培养皿 培养瓶与培养板 其它,培

12、养器皿1,培养器皿2,常用器械,解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等,常用器械,细胞培养的主要设备,基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。 光温控制设备 ：时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备 ：光学研究显微镜、倒置显微镜等。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。,电子天平,酸度计,不锈钢蒸馏水器,双重蒸馏水器,磁力搅拌器,灭

13、菌锅,灭菌锅,烘箱,过滤灭菌装置,紫外灯,超净工作台,培养架,光照培养箱,摇床,生物反应器1,生物反应器2,植物细胞培养反应器,显微镜,无菌技术,无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。 培养基 器皿材料 接种工具 操作环境 培养室 工作台面 具体的灭菌方法有多种 污染检测与控制,玻璃器皿清洗,浸泡刷洗浸酸冲洗,常用器械,无菌室,无菌操作室和无菌培养室 要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流,培养室1,培养室2,工作台面,灭菌种类,物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌 化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、

14、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢） 抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。 根据灭菌对象选择不同的灭菌方法,高温高压灭菌,原理：在121高温和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。 适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。,干热灭菌法,将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。 适用于玻璃器皿。,烘箱,射线灭菌,紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到灭菌效果。,过滤灭菌,原理：将带菌的液体或气体通过

15、孔径小于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。 常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。 组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。,过滤除菌装置,熏蒸灭菌,用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。 常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。,消毒液灭菌,依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。 70%酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等； 升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养

16、材料的灭菌。,室内灭菌,2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟 定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸,试剂和器皿的灭菌,包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌 培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌,灭菌锅种类,立式、卧式和手提式 操作步骤：加水 装料 密封 排气 升压 灭菌 降压 取物品 放水,污染检测与控制,细菌：可采用抗生素预防 真菌：可采用抗真菌剂防治 支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清 病毒：脱毒 细胞交叉污染：严格操作规程,显微技术,显微观察技术： 显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细

17、胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。,显微操作仪1,显微操作仪2,细胞观察与分析,细胞计数与活力分析 细胞固定与染色观察 凋亡细胞观察 染色体分析,细胞计数与活力分析,采用血细胞计数法计数 活力分析： 台盼蓝染色法：死细胞着色 MTT ：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力,血球计数板,计数法,细胞固定与染色观察,细胞固定 甲醇-醋酸 FAA Carnoy 细胞染色 苏木精-伊红（H.E)染色法 Giemsa染色法 Feulgen染色法 考马斯蓝染色法 免疫荧光法 免疫过氧化物酶染色法,凋亡细胞观察,形态观察: 生化分析: 锚定蛋白:检测凋亡早期 PI:检测晚期或死细胞 分子技术:梯形电泳图谱,形态观察,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,FITC-AnnexinV染色,FITC-AnnexinV和PI染色,梯形电泳图谱,染色体分析,样品处理:秋水仙素 低渗处理 固定化 染色观察,细胞分离,细胞初步分离 差速离心分离法 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离,琼脂平板培养,琼脂平板（培养淋球菌）,多孔板培养,流式细胞仪原理,激光捕获显微切割,免疫磁珠分离,细胞保存与复苏,目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法 预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将