酶工程课件.ppt

1、第一章 绪论,一、应用举例： 1、纤维素酶：酒精燃料，纺织品抛光和剥色，废纸脱墨。 2、蛋白酶：皮革软化，助消化剂，洗涤剂。 3、青霉素酰化酶：各种新型一内酰胺抗生素。,二、酶和酶工程极其主要内容：1、酶：是一种生物催化剂，即：具有催化作用的蛋白质或RNA。2、酶工程：酶的研究、生产和应用的技术。3、酶工程的主要内容：,优良产酶菌种的育种； 酶的分离纯化； 酶的分子修饰； 酶反应器； 酶的应用；,酶的发酵生产 酶反应动力学 酶与细胞固定化 酶传感器,三、酶工程发展概况,1、早期不知觉的利用阶段：酿酒，制饴。 2、认识酶的阶段： Pasteur:酵母中存在一种将葡萄糖转化为酒精的物质。 Bchn

2、er:酶在胞外也具有催化活性。 Sumner:分离脲酶结晶。 Michaelis:提出米氏方程。Koshland“诱导契合”理论 3、从生物组织或细胞中提取酶： 胰酶：皮革软化； 木瓜蛋白酶：啤酒澄清 4、酶的发酵生产： 日本人首先用液体深层发酵法生产-淀粉酶。,5、酶固定化： 日本人首先用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸； 日本人首先用海藻酸钙凝胶包埋酵母细胞生产啤酒； 6、发展趋势： *基因工程改造和表达酶 *酶法在化学合成中的应用 *开发新酶及其新用途 *酶的固定化,四、酶学基本概念,全酶 酶的活性中心 酶的别构调节作用 多酶体系 同工酶 酶原 诱导酶,五、酶学的一些新概念,1.酶的活性

3、中心:酶蛋白分子中一些基因在空间上相对集中形成一个直接参与底物识别结合和催化底物转变为产物的区域。 2.酶的别构调节:作用这种酶一般有多个亚基,除了活性中心外，还有可和别构调节物结合的别构部位,这两个部位可在不同的亚基上或在同一亚基的不同部位中，当调节物和别构部位结合后可引起酶的构象变化，导致活性中心对底物的结合和催化活性的改变，从而调节酶的活性. 3.全酶:含有辅助因子的酶,当酶辅助因子结合在一起时称为全酶. 4.寡聚酶:由多个相同或不相同的亚基组成的酶 5.多酶体系:由几种酶彼此以非共价键结合在一起形成的复合体,这些酶各催化不同的反应,它们组合起来催化一系列反应的连续进行。例如:脂肪酶合成

4、酶复合体.,6.诱导酶:当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶,它的含量在诱导物存在时显著提高。诱导物常是其底物或其类似物.例如:大肠肝菌的半乳糖苷酶(乳糖为诱导物).相对地,把细胞中含量较稳定，受外界影响较小的酶称为结构酶. 7.核酶(Ribozyme):具有催化活性的RNA.由Cech于1981年首次发现.1)四膜虫rRNA的自我剪切作用(self-splicing),2)RNase P 中的RNA具有使tRNA5一端成熟的作用,3)13srRNA具有肽基转移酶(Peptidy1 transferase)的作用.,8.模拟酶:在基本骨架上连接酶活性中心的化学基因而形成的,这些基因可以结合底物

5、并能催化底物转变为产物.例如: 1)胰凝乳蛋白酶的模拟酶：将Asp的羧基， His的味唑基和 Ser的羧基连接到环糊精上，发现其具有催化芳香酰类化合物的水解，但能耐和pH )谷胱甘肽过氧化物(GSHPx)的模拟酶: Glu-SelCys-Gly三肽也具有 GSHPx的活性,即催化 GSSG (还原型)+H2O2 H2O+ GSSG(氧化型谷胱甘肽).Se(硒)和 Cys相结合而形成 SelCys.,9.改造酶:主要是指利用蛋白质工程的方法改变酶的一级结构,从而使其功能或特性发生改变。例如： 1)将枯草杆菌蛋白酶的Gly166Lys166 后，水解谷氨酸相邻肽键的效率较原来的酶高500倍 2)葡

6、萄球菌核酸酶:该酶水解RNA或 DNA单链,但专一性很低.如果在其 Cys116上接上 22bp的 oligonucleotide,这时该酶只能水解与该寡核苷酸序列互补的序列的相邻核苷酸序列,从而提高了其专一性. (Gly-Phe) Gly-Phe,10.抗体酶:用底物过渡态类似物作为半抗原免疫动物，从而制备其抗体。这样得到的抗体理论上应能与底物结合并能发挥催化作用。例如:用三乙烯酰胺衍生物化学修饰的肽复合物(Gly-Phe)作为半抗原制备出能水解 Gly-Phe肽键的抗体酶.该方法为今后获得水解任何肽键的抗体酶奠定了基础,这对蛋白质一级结构的测定具有重要意义.,第二章 酶的发酵生产,一、有关

7、说明：本章内容在发酵工程中详细介绍。 二、从动植物组织中提取酶： 1、一些酶难以从微生物获得或表达：胰酶，木瓜蛋白酶。 2、缺点：工艺复杂、成本高、劳动强度大、难以大规模生产、酶的品质难以优化。 3、优点：投资小，技术条件要求低。,三、微生物发酵产酶,1、产酶细胞的条件：产酶量高，培养基廉价，产酶性能稳定不易退化，不易受噬菌体侵袭，酶易于分离纯化（胞外酶），容易培养和管理，安全无害。 2、发酵产酶的方法：固体培养发酵，液体深层发酵，固定化细胞发酵。 3、提高酶产量的措施：添加诱导物（底物或其类似物：青霉素可诱导青霉素酰化酶，IPTG可以诱导-半乳糖苷酶），控制阻遏物浓度葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶，

8、组氨酸合成酶，添加表面活性剂（吐温），添加产酶促进剂。 4、优点：胞外酶易于分离纯化，可以大规模地生产酶，可以用遗传学方法或基因工程方法改造酶，成本一般较低。 5、缺点：投资大，技术条件要求高。 6、发展方向：基因工程改造、克隆和表达产酶。,四、举例：5磷酸二酯酶的发酵生产：,1、液体深层发酵流程： 斜面培养：用8%麦芽汁琼脂培养基，30 培养三天。 种子培养：同上，接种于茄子瓶 发酵培养：培养基组成为5%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.05%K2HPO4、0.04%MgSO47H2O、0.04%CaCl22HO、0.02%ZnSO4 7H2O,调pH6.0 28 30 通风培养。当酶活力分泌达到

9、最大值时，即可停止发酵。下游提取：放罐，滤去菌体，即得粗酶液，10以下保存备用。,2、固体培养的流程：,斜面培养：将保存的桔青霉在察氏培养基上活化，28 72小时左右成灰绿色孢子。接入克氏瓶培养。 种子培养：麸皮100克和水150毫升搅匀，装入容积为2升克氏瓶中，消毒，接种后28 培养，72小时左右长成灰绿色孢子。 曲盘培养：一个克氏瓶接45个曲盘，接种量约为5%。每个曲盘（3545平方厘米）内装500克麸皮。麸皮：水=1：1.21.3。曲房温度为2628 ，需保持湿润。约34天后固曲培养到灰绿色时酶活力最强，应立即出曲。如果时间延长，菌变成深绿色时，酶活力下降，培养5天则变成褐绿色至褐色，活

10、力几乎全部消失。 浸取酶液：加35倍水浸取，滤去菌体即得粗酶液。,3、发酵曲线：,不管是液体培养或固体培养，菌体分泌5磷酸二酯酶的规律如图所示。在培养的前期，仅有菌的生长，并无酶的分泌，到菌的生长达直线生长期时，酶的分泌也呈直线增加。当菌的生长到禁止期时，酶的活力不再增加。时间过分延长回因污染杂菌而导致酶活力的下降。采用固曲培养时，此现象尤为明显。,第三章 酶的分离纯化,基本流程： 1、细胞破碎（胞内酶） 2、抽提（extract) （胞内酶） 3、固液分离 4、粗分离（蛋白质的选择性沉淀） 5、纯化 6、浓缩、结晶或干燥 7、产品化,一、细胞破碎,1、机械破碎法： *机械破碎法：设备简单，可

11、大规模生产，但破碎不完全并对酶活有影响。 *研磨法：研钵，球磨机和细菌磨，可大规模生产但效率低。 *匀浆法：不适于大规模生产，效率不高。 2、物理法： *温度差破碎法：温度突然变化使细胞破碎。细胞冻存。 *压力破碎法：设备复杂昂贵。 *超声波破碎法：1025KHZ，产热，处理样品少。,3、化学破碎法：有机溶剂或表面活性剂（Tween,triton),改变膜通透性。有机溶剂易燃易使酶失活，而后者常需用凝胶层拆除去。 4、酶法：溶菌酶作用于细胞壁的-1，4糖苷键。几丁质酶作用于霉菌细胞壁中的几丁质。缺点：价格贵，且不利后续分离纯化。 5、自溶法：在一定pH和温度下，利用自身的酶使细胞裂解。在保温过

12、程中，目的酶会失活，而且会滋生其它微生物。,二、酶的抽提,1、酶的抽提是指在一定条件下，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 2、需要考虑的因素： *温度：一般在0 10 *pH：一般远离目的酶的等电点 *抽提液的体积：一般为酶原料的3 5倍体积 *添加保护剂：蛋白酶抑制剂，抗氧化剂或酶的稳定剂 *离子强度：有利于提高酶的溶解度,三、固液分离,1）离心方法：量小，产热，价格贵。离心机的种类：管式离心机，碟片式离心机，卧式沉降离心机等。 2）过滤：压力过滤器、板框式过滤器、布袋过滤。过滤介质有：滤纸、滤布、玻璃纤维、陶瓷滤板等。助滤剂有：硅藻土、活性炭、纸等。,四、酶的粗分离,酶的粗分离就是指酶的选择性

13、沉淀，及：用一定方法把目的酶沉淀出来或把杂蛋白沉淀除去。 1 盐析沉淀法 1）什么是盐溶现象？什么是盐析？ 2）什么是分级盐析法？ 3）为什么硫酸铵是盐析最常用的盐？ 在水中的溶解度大，溶解度受温度影响小，价廉。 4）盐析沉淀法有何优缺点？,2、 有机溶剂,1）有机溶剂具有降低水的介电常数和破坏水化层的作用，从而使酶沉淀。 2）常用有机溶剂：乙醇，丙酮，异丙醇等。 3）优点：分辨率高，所得的酶沉淀易于分离且不含无机盐，易于后处理。 4）缺点：有机溶剂易使酶变性，需低温操作；易燃、易爆、有毒。,3、 等电点,1）原理：在pH为酶的等电点时酶分子所带的净电荷为零，从而易聚集沉淀。 2）缺点：在等电

14、点时酶分子表面的水膜仍然存在，所以酶仍然有一定的溶解度而沉淀不完全。 3）等电点法常用于和其它沉淀法联合使用来沉淀酶和用于从粗酶中除去杂蛋白。,4 复合沉淀法,1）复合沉淀法：某些物质可以和酶形成复合物而沉淀下来，分离沉淀后又可以用适当方法解离出来，从而达到分离酶的目的。 2）常用沉淀剂：单宁、聚丙烯酸。 3）例如：聚丙烯酸在pH3-5时和酶结合沉淀析出，pH6以上则二者分离，用2N H2SO4处理聚丙烯酸可重复使用。 5 选择性热变性,五、纯化,1 分子筛层析 2 离子交换层析 3 亲和层析 4 电泳 5 吸附层析,六、举例:核酸酶的提取和精制,1、粗酶液的制备 若采用液体培养法，发酵液经布

15、袋压滤除去菌体，即得金黄色透明粗酶液，在10 下保存。若采用固体培养法，10倍的40-50的水保温，浸泡和间歇搅拌1小时后，用布袋压滤，即得粗酶液。在5-核苷酸的工业生产上，一般均直接使用粗酶液。,2、酶粉制备,预冷的酶液加入三倍体积预冷的工业酒精，使终浓度达70%以上。酶便呈絮状沉淀大量析出，放置过夜。所有操作温度要求在5 左右。吸去上清液（回收酒精），离心得到酶糊，真空干燥或吹风干燥，得到固体，研磨成粉，即为酶粉。一升发酵液通常可得1-2克酶粉，活力回收在70%以上。酶粉十分稳定，密封后在室温下可保藏一年以上。具有体积小、易保藏的优点。,3、纯酶制剂的制备,对此酶的性质进行研究或欲将此酶用

16、于核酸的结构研究，则需要制备较纯的酶制剂。日本曾将此酶纯化了1，500倍，得到一个超离心和圆盘凝胶电泳均一的纯酶制剂。所有操作均在4 进行。 （1）抽提：20千克固曲用60升自来水浸泡2小时，间歇搅拌，布袋压滤，得到50升粗酶液。 （2）第一次硫酸铵沉淀：加入34千克硫酸铵达0.9饱和度，放置过夜，离心，沉淀溶于1.5升去离子水中，透析过夜。 （3）热处理：在透析好的酶液（2 .3升）中加1MZnCl2溶液上使终浓度为7103 M，用0 .1NNaOH调pH至5.3，在70水浴中搅拌加热至60，再移至63水浴中，在63不断搅拌维持15分钟，用冰浴冷至5，离心除去沉淀得2 .5升酶液。经这步处理

17、可钝化其他不需要的酶，例如水解RNA生成3-核苷酸的核酸酶、非专一的磷酸酯酶和5-核苷酶。,（4）第二次硫酸铵沉淀：加入750克硫酸铵，饱和度为0.4，放置过夜。离心除去沉淀。再加820克硫酸铵使上清液达0.8饱和度，放置过夜。离心收集沉淀，再溶于265毫升去离子水中，透析过夜。 （5）丙酮沉淀：270毫升冷丙酮（-10）加入420毫升透析液中，搅拌30分钟，放置2小时后，在-5离心10分钟，将沉淀，溶于188毫升0.05M醋酸缓冲液（pH 6.0）中，透析。 （6）第一次葡聚糖凝胶G-100过滤：凝胶柱用上述缓冲液平衡后，样品上柱，用同样的缓冲液以20毫升/小时的流速过滤，收集比活力较高的溶

18、液2升，加1，368克硫酸铵达0.9饱和度，放置2小时，离心，沉淀溶于25毫升0.05M醋酸缓冲液（pH 6.0）中，并对缓冲液透析。,（7）第一次DEAE纤维素柱层析：将酶活力峰收集得300毫升，加入205克硫酸铵，0.9为饱和度，放置2小时，离心，沉淀溶于20毫升0.05M醋酸缓冲液（pH 6.0）中，并对缓冲液透析。 （8）第二次DEAE-纤维素柱层析：所得的26毫升浓缩酶液用同样方法在DEAE纤维素柱层析一次，酶集中在一个峰内流出，收集后透析过夜，得12毫升。 （9）第二次葡聚糖凝胶G-100过滤：酶活力集中在一个峰内。收集后对流动蒸馏水透析过夜。透析液放在盛有P2O5的干燥器里在4 冷冻干燥。得到纯的酶制剂。超离心检查只有一个峰，电泳也是均一的，等电聚焦结果也是一个蛋白峰，等电点为4.5。,问题：,1、制酶粉时为何用有机溶剂沉淀而不用盐析？ 2、得到酶沉淀后能否停下来室温放置过夜再做（会变性和变坏吗？） 3、鉴定酶是否纯的方法有哪些？ 4、硫酸铵饱和度是指什么？,第六节 酶制剂,一、种类： 状态：液体、固体（粉末、冻干粉、结晶） 二、级别： 医药级：纯 无抗原 食品级：无重金属、细菌含量不超标 工业级： 研究级：,三、各种酶制剂的特点,1、冻干粉、SOD稳定价格贵、医药或保健品 2、粉末：稳定可大量生产，价格低，食品级 3、液体：价格便宜，不稳定，不易