Genome engineering using the CRISPR.ppt

1、genomeengineeringusingthecrispr-ca s 9系统，前言CRISPR-Cas9发展历史CRISPR-Cas9结构，作用机制CRISPR-Cas9的构建CRISPR-Cas9最近，美国约翰霍普金斯大学医学部的科学家研究人员发现，这一发现可以简化诱导多能干细胞(iPSCs )的修改和定制，有望更快地取得治疗成果，并开发了用于疾病研究和药物检测的模型系统。 相关论文在最近的分子治疗上在网上发表了。 CRISPR来自微生物的免疫系统，该工程编辑系统利用一种酶，可以将作为一段导向工具的小RNA切入DNA，在此可以切断或进行其他修饰。 以往的研究表明，这些介入使CRISPR能

2、够更有效地改变和突变基因组，比TALEN (转录活性因子类受体核酸酶)等其他基因编辑技术效率更高。 但是最近的研究发现，CRISPR有很多优点，而在人癌细胞系中，修正特别不想变化的基因的“错误目标”有可能大量发生。 近年来，随着人类基因组测序的完成和全基因组测序技术的发展，复杂基因组中未知基因功能的探索具有生物学定点研究、临床医学以及基因治疗所不能替代的作用。 长期以来，基于同源重组机制的基因敲除技术被广泛应用于基因功能的研究，但该技术在实际工作中效率低、工作繁琐，并且可能引起基因突变等问题，使基因功能的研究变得困难。 随着生物技术的发展，基因组编辑技术经历了三代技术的发展：锌指核酸酶(zin

3、c fingernucleases，ZFN )、转录活化子样效应因子核酸酶(transcriptionactivatorlikeeffecor t 和规则性重复短句子序列簇和Cas9蛋白(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR/Cas9)。Cas9:基因组编辑中RNA指导的核酸酶，CRISPR-Cas利用微生物获得免疫系统，RNA指导的核酸酶(I -)，分别剔除源基因。 在广泛的细菌和古细菌宿主中已经鉴定的三种CRISPR系统都含有一段CRISPR相关(Cas )基因、非编码RNA和一系列独特的重复元素(正向重复序

4、列)。 这些重复序列是来自外来DNA目标的被称作protoapacers的短可变序列分离，他们共同形成CRISPR RNA(crRNA )序列，目标DNA序列中的每个protospacer接近于前一区间序列和基底(PAM ) 根据、Cas核酸酶类型，Type系统是CRISPR/Cas系统中Cas蛋白质最多、最复杂的系统，包含6个蛋白质， 其中具有特征性Cas3蛋白的该蛋白与外消旋酶和多个具有核酸酶功能的Cas蛋白成熟的crRNA结合形成CRISPR相关病毒防御复合体cascad (crisprassociatedcomplexforantivirusde CAScad与侵入的外源DNA结合，使

5、cascad内的crRNA和外源DNA的互补链对形成r环结构，Cas3核酸酶在识别r环结构后切开互补链，然后在Cas3外消旋酶和核酸酶的作用下切开非互补链，形成cas核酸酶类型编码指南RNA的crRNA序列和必要的辅助转录激活crRNA(tracrRNA )促进了tracrRNA加工成crRNA序列的小片段。 各crRNA单元包括20nt的诱导序列和部分正向重复序列，前者指导Cas9配对成碱基互补对，与20bp的目标DNA配对。CRIEPR-Cas系统来源于化脓链球菌(本草案中使用的系统)，目标DNA必须直接位于5-NGG PAM之前，而其他Cas9同系物则包含不同的PAM，如嗜热链球菌(对于

6、CRISPR 1的5-NNAGAA和CRISPR 1) Cas核酸酶类型介绍，Type系统含有特征性的Cas10蛋白，其RNA酶活性和类似Type的CASCAD功能Cas10主要参与crRNA的成熟和剪切侵入外源DNA，目前Type参与Type A和Type B激烈热球菌的Cas10 发现了crispr这两个亚型的葡萄球菌CRISPR/Cas系统是Type B型，其目标与Type和CRISPR/Cas系统相同，是DNA，反映了自然界CRISPR/Cas系统的多态性， Cas9利用HNH和RuvC核酸酶区域进行链特异性切割，这是因为可以追加利用的RuvC催化区域的海藻酸盐丙氨酸(D10A )突变

7、使Cas9切口酶突变体(Cas9n )切开DNA，而不是撕开DNA，而是将单列DNA碎片由于合适的抵消对sgRNA可以被诱导为Cas9n同时切开DNA两链上的靶部位调节DNA双链切断(DSB )，因此可以有效地提高靶识别的特异性。 另外，Cas9突变和DNA切口催化剂残基突变适应了大肠杆菌转录控制的开始，说明了Cas9在不同用途发挥功能的可能性。 例如，募集荧光蛋白标记和染色体修饰酶特异基因部位的报告和基因功能的调节。 与、其他基因组编辑技术相比，通过简单地购买一对oligos代码就能够容易地定制20-nt的一个序列，Cas9能够将新的DNA序列作为重新目标。 与此相对，TALEN重新靶向新的

8、DNA序列需要重构2个新的TALEN基因。 有很多TALEN构筑草案，但实际上构筑新的TALENs需要更多的操作时间。 切割模式WT S.pyogenes (化脓链球菌) Cas9(SpCas9)在目标基因序列的第17个和第18个碱基之间(PAM3bp5)进行低效(blunt )切割。 通过突变SpCas9中RuvC或HNH的核酸酶区，可以将酶转化为DNA切口酶。 与此相对，TALENs非特异性地切开了一对TALEN之间的12-24bp的单体连接位点。 编辑效率在多种多样的细胞核生物中表现出SpCas9和TALENs促进基因组编辑效率的作用。 然而，这是一个简单的目标击中，Cas9允许同事击中

9、多个基因组部位，在Cas9系统的限制下，Cas9可以通过sgRNA上20-nt的诱导序列击中特定的基因组部位。 选择Cas9靶点的唯一要求是PAM序列3端20bp靶点序列的存在。 每个Cas9的直接同源都包含唯一的PAM序列，例如，SpCas9需要5-NGGPAM序列。 该PAM的要求在人类基因组中没有严格限制靶的范围，该靶部位平均每8-12bp被发现一次。 除靶范围外，其他可能的限制是潜在的脱靶突变Boxes1和2有图的突变最小化的详细和策略。CRISPR/Cas作用机制包括：第一是获得CRISPR高度可变的间隔物，第二是CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)，第三是发挥CR

10、ISPR/Cas系统活性或干扰外源遗传物质， CRISPR的高度可变其实是外来侵入的噬菌体和质粒DNA的短DNA序列被嵌入宿主菌的基因组中，嵌入位置位于CRRSPR端的2个重复序列之间(repeats )， CRISPR基因座中的间隔序列，将5至3的序列也是与记录外来遗传物质侵入的时间序列的噬菌体和质粒上的间隔序列相对应的序列称为protospacer，通常在protospacer的5或3末端延伸几个碱基序列称为PAM(protospacer adjacent motifs )其长度一般为25碱，一般距离proto spacer 14碱，获得新的间隔序列可分为三个步骤：识别侵入的核酸，将外源D

11、NA的潜在PAM 并且，将在CRISPR基因座的5端合成重复序列的最后一个新的间隔序列整合到两个重复序列之间(图2 )，目前，仅第一步被证实，Cas1和Cas2蛋白质是负责获得新的间隔序列的核心蛋白质，tas Cas系统中的Csn2蛋白也是获得新的间隔序列所必需的，干扰使CRISPR/Cas发挥了防止外源遗传物质侵入的最重要步骤，成熟的crRNA和特异的Cas蛋白形成核酶复合体，与外源DNA结合扫描到外源DNA，其外源DNA在配对的特定位置被核核核蛋白复合体切断的初期研究中，认为crRNA的间隔序列(spacer )与外源DNA的目标部位完全互补配对是切断所必需的，但后续的研究中spacer与

12、protospacer sgRNA中20-nt的诱导序列决定了Cas9核酸酶的特异性。 在S.pyogenes系统中，目标序列必须紧接在5-NGG PAM之前，20-nt的诱导序列碱基与相反的链成对，Cas9必须调节为在PAM1的上游约3bp处切断。 注意： PAM序列必须直接给予目标DNA位点，但不是sgRNA中20-nt诱导序列的一部分。 (I )在i)S.pyogenes Cas9系统中的5-NGGPAM(ii )最小化的去靶活性这两个主要注意事项，是为了、而在基因靶上选择20-nt诱导序列。 我们提供CRISPR系统的在线设置修订工具，能够识别我们感兴趣的基因序列和适当的目标位置。 为

13、了实验评价各sgRNA的脱靶基因组修饰，我们还提供了各目标计算机预测的脱靶部位、sgRNA的构建和递送途径方法，根据需要，sgRNA以PCR扩增所含表达盒的sgRNA表达质粒的形式递送在基于PCR的sgRNA递送产物中加上制定的sgRNA序列，利用逆PCR扩增U6启动子模板。 所得扩增产物可与Cas9表达质粒pSpoCas9一起转染。 该方法是筛选多个sgRNAs候选者的最佳方法，且在获得sgRNA编码引物之后不久就可进行细胞转染并作功能测试。 该简单方法消除了基于质粒的克隆和测序的需要，适用于检测或共同转染大量sgRNAs建立大型敲除库或其他敏感范围的应用。 注意： sgRNA编码引物大小超

14、过100bp，与约20-bp长度的寡核苷酸线相比，需要基于质粒的sgRNA递送。 sgRNA表达质粒的构建也简单快速，包括一对部分互补寡核苷酸的简单克隆工艺。 编码20-nt诱导序列的寡核苷酸对退火延伸到质粒(pSpCas9(BB ) )，该质粒接受sgRNA残基，作为固定的支架紧接在寡核苷酸克隆位点之后结合。 转染的质粒也被修饰，病毒可以产生用于体外分发。针对这些方法，下面的这些质粒可用于该方案：单独的Cas9(pSpCas9)或包含用于诱导序列插入的固定sgRNA支架和克隆位的Cas9(pSpCas9(BB ) )。 对于克隆的主干，将2A-GFP或2A-Puro融合到Cas9中，转染细胞

15、(pSpCas9(BB)-2A-GFP或pSpCas9(BB)-2A-Puro )。 各部位的相同臂的长度是可变的，但典型的长度超过500bp。 该方法可以用于荧光蛋白质和抗生素耐性标记等报告基因的插入等产生大的修饰。 目标质粒的设置修订和构建已经在其他地方阐述。 最近，ssODNs已被用于在无克隆确定位点取代目标质粒而获得短修饰。 为了获得高HDR效率，ssODNs在各路径中包含至少40bp的侧翼排列，它们与目标区域为同源，它们可以在目标部位的正义或反义方向上调整。 请注意，打靶效率根据细胞的类型、打靶部位、模板来源的类型以及对DBS部位的修饰位置而有很大差异。 一般来说，从DSB网站到10

16、0bp，单碱基校准的概率下降到约4倍，超过200bp的修正需要使用药物筛选标记。 优选单克隆细胞系，具有特定修饰的单细胞系克隆。 转染后通过流式细胞仪(FACS )或连续稀释分离个体细胞获得，然后在细胞增殖期建立新细胞系。 值得注意的是，细胞的类型将大大改变他们对单细胞隔离的反应、功能检测和核酸酶分析检测。 在细胞内转染一对sgRNA调整基因组的(微小的)缺失或倒置，我们可以通过核酸酶分析检测缺失突变或测序。 我们的在线CRISPR设置修订工具为两种处理方法提供了推荐的底漆。 但是，检测和测序的引物可以手动修订，扩大基因组DNA中感兴趣的范围。 所有传统引物均选自国家生物技术信息中心(NCBI)primer-BLAST，以避免非特异性扩增。Cas9靶序列两侧的200-400bp碱基(总扩增产物为400-800bp )应该扩增引物，这可以通过凝胶电泳清楚地看到切片。 为了避免形成过量的引物二聚体，将检测引物修改为典型的18-25nt长度，变形温度约为60。 为了分析鉴定或序列分析，我们建议对各候选引物产生的单一PCR产物进行测试，测试核酸酶消化过程缺乏的非特异性切割反应，质粒或ssODN调节的HDR HDR可通过PCR