做Westernblot仪器Odyssey

1、Odyssey红外激光成像系统 蛋白研究的多功能平台,Western Blot 常见检测方法,化学显色法 如DAB显色 放射自显影法 如同位素 化学发光法 如 ECL 化学荧光法 如IRdye680、IRdye780 ,化学显色法操作简便，无需暗房和显影设备，显色直观，但灵敏度较低，国外已不常见。 化学发光法（ECL）比化学显色法灵敏度高，可达pg水平。但由于是酶促反应，不同曝光时间得到的信号与样品量不成线性关系 ，不能做准确定量。 荧光法采用荧光检测原理，操作简单，荧光信号强弱直接反映目的蛋白量，可进行精确定量；还可以根据荧光染料的不同，用不同的荧光二抗可以在同一张膜上同时检测两种蛋白质。,

2、不同检测方法特点,ECL常见问题,暗房操作麻烦，曝光时间难以控制，无法准确定量 背景高，高浓度蛋白易出现“吹泡”现象 检测两种蛋白时，需要Stripping和Re-probe，操作复杂 胶片上无法直接观察到Marker,解决方案：Odyssey,双色红外荧光成像系统 荧光 红外 双色 荧光准确定量、线性范围宽广 红外背景低、信噪比高 双色同时检测、同时输出,Odyssey VS ECL流程,荧光直接检测,INFRARED LASER DIODE,INFRARED APD DETECTOR,ON-SCREEN Display,信号持久 不需要底物 不需要底片/暗室,荧光准确定量,TIME,TIM

3、E,CHEMILUMINESCENCE 动态信号信号随时间变化 信号不与目标蛋白浓度成比例关系,ODYSSEY 静态信号信号不随时间变化 信号和目标蛋白浓度成比例关系,High concentration / signal,Medium concentration / signal,Low concentration / signal,0,0,0,0,INTENSITY,红外荧光 VS 化学发光 定量线性范围,Odyssey能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高） Odyssey成像呈现一个很好的线性（定量准确）,ECL,ODYSSEY,Odyssey系统定量的线性相关性,倍比稀释的 IRDye

4、800-标记的抗体. R2 从1.5 ng to 0.8 pg 是 0.99996, 极佳的线性相关性。,1.5 ng,0.8 pg,极佳的线性相关性增加了定量的准确性,Dilutions of transferrin detected with rabbit anti-Tf primary and Alexa Fluor 680 goat anti-rabbit secondary. Sensitivity is 250-fold higher than reported for the Bio-Rad Molecular Imager FX with fluorescent antibod

5、ies, 100-fold higher than ECL (BioTechniques 29:636-642).,红外荧光 VS 化学发光,红外荧光 VS 化学发光 成像效果,Odyssey,曝光秒,曝光分钟,曝光分钟,曝光分钟,红外+荧光 DEMO,实验步骤,Odyssey: 膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像 ECL: 膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+ UVP扫描成像,实验目的 检测培养细胞转染外源基因的表达状况,Marker S1 S2 S3 S4,Marker S1 S2 S3 S4,Odyssey结果,ECL结果,信号强度 51 20 10 4,信号强度

6、302 62 30 19,（Odyssey软件分析结果）,结论,Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大 Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果 Odyssey扫描图能同时看到Marker 和目标蛋白，ECL看不到 Marker,10:4:2:1 稀释,红外技术优点低背景,红外荧光 vs 可见荧光 膜背景信号,背景更低，信噪比高，保证更好检测灵敏度 定量线性范围更宽，可达4个数量级，定量更准确 穿透力更强（活体成像的应用）,红外荧光优点,Odyssey双色同时检测,800 nm,700 nm,Overlay,两套独立激发检测系统 700通道：680nm激发 720

7、nm检测 800通道：780nm激发 820nm检测,靶蛋白+靶蛋白 核酸+结合蛋白 Marker + 总蛋白 参比蛋白 + 靶蛋白 总蛋白 + 修饰化蛋白,Odyssey双色应用,No need to strip!,No need to re-probe!,双通道同时检测,Target protein Anti-rabbit 800 channel,Normalizer target Anti-mouse 700 channel,* Two-color detection requires primary antibodies from different hosts,双色ERK蛋白的磷酸化

8、,Anti-EGFR and anti-phospho-EGFR antibody specificity in A431 cells,Single color images (B and C) can be overlaid (A) to show both total protein and phosphorylated protein.,The mobility shift caused by phosphorylation is visible (A) as indicated by the red bands above the yellow bands. (yellow indic

9、ates overlapping red and green signals).,双色EMSA,Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).,700 and 800 Overlay,700 nm Channel,800 nm Channel,DNA-Protein Complex,Unbound DNA IRDye 800,Unbound DNA IRDye 700,Ody

10、ssey双色检测的优越性,双色输出，两个目标基因同时检测，减少了工作量，而且杂交条件均等，便于两个数据的对比 杂交结果对比输出，结论更加直观，一目了然 可进行准确的量化分析,In-Cell Western Assay,The Odyssey In-Cell Western (ICW) Assay is a high-throughput approach to simultaneously detect and quantify two separate proteins directly within cells.,In-Cell Western Assay,细胞培养 Culture cel

11、ls to confluency in 96-well or 384-well plates,处理细胞 Treat cells (inhibitor, stimulator, etc),固定细胞 Fix cells (3.7%formaldehyde, methanol or Prefer),透化细胞 Permeabilize cells (0.1%Triton-X 100),Odyssey系统扫描 Scan plate directly and analyze on the LI-COR Infrared Imaging Systems.,In-Cell Western 工作流程,Membr

12、ane Westerns vs ICW,EGF对ERK磷酸化水平的调控,700 nm (Total ERK),800 nm (Phospho-ERK),Composite Image Overlay,EGF Concentration,A431 cells stimulated with serial dilutions of EGF to optimize activation of ERK1/2. Phospho-ERK signal was normalized using total ERK signal.,EGF抑制剂对ERK磷酸化水平的影响,Quantitative and sim

13、ultaneous measurements of total ERK and phosphorylation of ERK in response to EGF in the presence of EGFR inhibitor.,In-Cell Western 软件模块,在用客户提供的结果,图片由上海中医药大学复杂系统研究中心Dr Liu提供。,Odyssey ICW 的优点,高速 与普通膜杂交相比，通量提高30倍 ICW 软件提供便捷的计算和分析 准确 红外检测提供最准确的量化结果。 避免在细胞裂解等步骤中蛋白的损失。 操作简单 操作步骤简单,ICW相关试剂,目前可以提供4种试剂盒,其他

14、经ICW验证的抗体以及kit,应用文献一,P,P,P,P,EGFR,Ras,Raf,Mek,ERK,JAK,STAT1,STAT3,Grb2,SOS,EGF,EGFR Signaling,RAS/RAF/Mek/ERK信号通路,KSR1,左图：The effect of KSR1 phosphorylation on MEK1/2 and RSK1 activation.,上图：Mutation of KSR1 phosphorylation sites enhances the duration of ERK activation.,应用文献二,蛋白质芯片扫描,CST PathScan RT

15、K Signaling antibody array kit(7949) kit包括：所有的辅助产品和试剂 R&D 4种适合Licor检测试剂盒,小动物活体成像-双色,小动物活体成像-附件,软件功能,仪器软件 Administration Diagnostics 应用软件 图象控制 背景扣除 条带发现和定位 定量 ICW % 结果计算(including normalization) 小动物活体分析,Odyssey系统发表文献统计,Paper List,Nagashima, K., et al. Genetic and pharmacological inhibition of PDK1 in

16、 cancer cells characterization of a selective allosteric kinase inhibitor J. Biol. Chem 286:6433 (2011) Sneeringer, C.J., et al. Coordinated activities of wild-type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27) in human B-cell lymphomas PNAS 107:20980

17、 (2010) Cittelly, D. M., et al. Oncogenic HER2D16 suppresses miR-15a/16 and deregulates BCL-2 to promote endocrine resistance of breast tumors Carcinogenesis 31:2049 (2010) Pan, Y. et al. Sprouty2-modulated Kras signaling rescues Shp2 deficiency during lens and lacrimal glad development. Development

18、 137, 1085-1093 (2010) Markovic, D et al. Intracellular mechanisms regulating corticotropin-releasing hormone receptor-2beta endocytosis and interaction with extracellularly regulated kinase 1/2 and p38 mitogen-activated protein kinase signaling cascades. Mol Endocrinol. 22(3): 689-706 (2008),总 结,准确定量提供更完善的数据，提升文章档次 成像效果好背景低，条带清晰，没有